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烟曲霉IgG抗体检测在慢性肺曲霉病中的意义

2019-08-20刘扬李彦芹马秀清解立新

国际呼吸杂志 2019年15期
关键词:曲霉菌真菌阳性率

刘扬 李彦芹 马秀清 解立新

中国人民解放军总医院呼吸科,北京100853

肺曲霉病是感染曲霉菌后引起的一种慢性疾病,可侵犯皮肤、黏膜、鼻腔、肺、神经等,在各种曲霉中主要以烟曲霉为主。根据病原菌的致病力可分为致病性真菌和条件致病性真菌。致病性真菌本身具有致病性,条件致病性真菌致病性低,通常不感染正常人,但正常人大量接触后或免疫功能低下者容易感染,烟曲霉就是其中的一种条件致病菌。根据我国目前的流行病学资料,在非血液恶性疾病患者中肺真菌病主要有肺曲霉病 (37.9%)、肺念珠菌病 (34.2%)、肺隐球菌病 (15.6%)、肺孢子菌病 (4.8%)、肺毛霉病 (2.1%)、肺马尔尼菲蓝状菌病和组织胞浆菌病[1]。可见肺曲霉病在非血液恶性疾病患者中占有很大的比重,应该受到重视。慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis,CPA)是一种难治的肺部疾病,发病比较缓慢,其进程往往持续3个月以上,常合并其他呼吸疾病,如不积极治疗,5 年病死率较高(75%~80%),因此需提高临床医师对CPA 的全面认识,以期尽早明确诊断,并给予恰当治疗,以降低其病死率。

目前上市的抗体检测试剂盒,能检测血清曲霉特异性IgE类抗体,仅对变应性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)有诊断价值。国内天津丹娜公司正在开展曲霉IgG类抗体检测的临床实验,试图通过IgG 检测提示疾病的发生及进展。过去人们对曲霉抗体检测的研究并不清楚,随着近年来对侵袭性曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)研究的深入,尤其是对CPA 认识的加深,以及GM 试验对CPA 的诊断效果不尽如人意,科研人员越来越重视曲霉菌抗体检测在IPA 尤其是CPA 诊断中的作用[2]。在2015年出版的欧洲CPA 诊断和治疗的临床指南中[3],特别强调了曲霉IgG 抗体检测、曲霉IgM 抗体检测和曲霉IgE抗体检测在CPA 诊断中的重要作用。2016年更新的美国感染病学会(Infectious Disease Society of America,IDSA)曲霉病诊断与处置指南中,更是强调了曲霉IgG 抗体检测是慢性空洞性肺曲霉病诊断中最灵敏的微生物学方法[4]。因此,为了评估其临床诊断价值,及时的监控患者病情并进行及时诊治,需要尽早开展此项检测工作。

1 材料与方法

1.1 材料来源 2017~2018年在解放军总医院呼吸科实验室复查血清烟曲霉IgG 抗体的患者血清42例,年龄 (51.8±14.5)岁,年龄范围17~85岁,男23例,女19例。血清保存在-80 ℃冰箱。本项目已经得到解放军总医院伦理委员的审查和批准(S2017-015-01)。

1.2 实验试剂 天津丹娜公司生产的烟曲霉IgG抗体检测试剂盒。

1.3 实验仪器 北方同正生物技术发展公司HQ-60旋涡混合器;北京医用离心机厂LG10-2.4A高速离心机;美国Bio Tek Instruments,Inc.ELX800全自动酶标仪。

1.4 实验方法

1.4.1 血清烟曲霉IgG 抗体水平的测定 采用酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法,操作严格按照试剂盒说明书进行:(1)试验前将试剂盒取出,置于室温 (20~25 ℃)达30 min;(2)打开装有酶标板的密封袋R1,将暂不用的板条放回密封袋内封好,保存在2~8 ℃;(3)配制工作洗涤液,浓缩洗液稀释20倍 (1份浓缩液加19 份的无菌去离子水或超纯水),稀释后的工作洗涤液可在2~8 ℃保存2周。若浓缩洗液出现结晶,请30 ℃水浴溶解后使用;(4)样本稀释,待测样本需用样本稀释液稀释1 000倍 (1份样本加999份样本稀释液);(5)留第一孔做空白对照,其余各孔依次加入烟曲霉IgG抗体标准品、质控品A、质控品B 和稀释后的血清样本各100μl;(6)贴上封板膜,样品于37 ℃条件下孵育 (60±5)min; (7)洗涤,揭开封板膜,洗涤酶标板。每孔每次加入不少于300μl的洗涤液,静置40 s后将酶标板孔内液体除去,在吸水纸上反复拍打去除残留液体,重复上述洗涤操作,共洗涤3次;(8)每孔加入100μl酶标抗体;(9)贴上封板膜,在37 ℃条件下孵育 (30±1)min;(10)同步骤 (7);(11)每孔加入底物溶液100μl; (12)在37 ℃条件下孵育15 min,避光;(13)每孔加入50μl终止液,加样顺序与加入底物溶液的顺序一致,混匀;(14)加入终止液后,在5 min内于酶标仪450 nm 波长处读吸光度值 (OD 值)。

1.4.2 结果判读 烟曲霉IgG 抗体滴度≥120 AU/ml,则定为阳性;烟曲霉IgG 抗体滴度在80~120 AU/ml,定为可疑阳性;烟曲霉IgG抗体滴度<80 AU/ml,则定为阴性。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计分析软件处理数据。两组定量数据之间的比较用t检验,结果以±s表示,率的比较用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗真菌治疗前后血清烟曲霉IgG 检测阳性率变化 42例患者分别在3个月内复检烟曲霉特异性IgG 抗体。除外16例阴性患者及5例未抗真菌治疗患者,余下阳性 (16例)和可疑阳性 (5例)患者21例给予伏立康唑、伊曲康唑、氟康唑等抗真菌药物治疗。其中,阳性患者治疗后阳性比例降至68.75%,其余31.25%转为可疑阳性 (18.75%)或阴性 (12.5%);但是可疑阳性患者治疗后,可疑阳性的比例占60%,阴性比例占20%,阳性比例占20%。阳性或者可疑阳性患者治疗后转阴比例均呈明显增高的趋势,患者对抗真菌治疗比较敏感;同时也提示该试剂盒所测阳性患者血清烟曲霉IgG 的变化能够反映疾病的发生与发展进程。

2.2 抗真菌治疗前后血清烟曲霉IgG 水平的变化分别对16例阳性和5例可疑阳性患者血清烟曲霉IgG 水平进行分析,抗真菌治疗前后,分别用配对t检验统计分析。抗真菌治疗后阳性患者血清烟曲霉IgG 水平显著下降 [(243.00±131.73)AU/ml vs(141.11±46.96)AU/ml,t=2.910,P<0.01],差异有显著统计学意义;可疑阳性患者治疗前后血清烟曲霉IgG 水平无显著变化。表明,抗真菌治疗能够显著降低CPA 患者血清中烟曲霉IgG 的水平,但是对可疑阳性患者效果不明显(表1)。

表1 治疗前后烟曲霉IgG 水平比较 (AU/ml,±s)

表1 治疗前后烟曲霉IgG 水平比较 (AU/ml,±s)

注:与治疗前比较,aP <0.05

组别 例数 治疗前 治疗后阳性组 16 243.00±131.73 141.11±46.96a可疑阳性组 5 97.39±13.55 99.10±30.16 t值 2.425 1.866P 值 0.026 0.078

2.3 阳性患者抗真菌治疗前后血清烟曲霉IgG 检测阳性率比较 治疗前16例患者血清烟曲霉IgG水平>120 AU/ml,治疗后11例>120 AU/ml,5例<120 AU/ml。卡方检验结果表明,抗真菌治疗后烟曲霉IgG 阳性率显著下降 (χ2=5.926,P=0.015)。对血清烟曲霉IgG 阳性患者进行抗真菌治疗切实有效,能够显著降低患者血清烟曲霉IgG的阳性率。

2.4 临床诊断肺曲霉菌感染患者抗真菌治疗前后IgG 水平的比较 16 例阳性患者血清烟曲霉IgG水平>120 AU/ml,其中12例临床诊断为肺曲霉菌感染,对其抗真菌治疗前后血清IgG 水平用配对t检验统计分析。结果表明,抗真菌治疗前IgG水平为 (263.13±146.50)AU/ml,治疗后烟曲霉IgG 水平为 (150.02±49.37)AU/ml,呈显著下降 (t=2.530,P<0.01)。并且,治疗前肺曲霉菌感染患者临床症状如体质量减轻、全身乏力、盗汗和食欲下降、及慢性咳痰、呼吸困难、胸部不适的患者 (9例)占比75%,抗真菌治疗后占比 (4例)33.33%,呈显著下降 (χ2=4.200,P=0.041)。但是抗真菌治疗后患者3 个月复查肺CT,仅有2例影像学病灶较治疗前缩小,10例患者治疗前后影像学病灶吸收无显著变化。临床诊断肺曲霉菌感染患者检测血清中IgG 水平变化的指导意义优先于影像学结果。

3 讨论

CPA 的诊断需同时满足以下条件: (1)胸部影像学的特征性表现;(2)曲霉菌感染的直接证据(显微镜或活组织培养)或曲霉菌免疫反应阳性;(3)排除其他疾病,病程超过3个月[3]。曲霉菌免疫反应中比较常见的就是特异性IgG 抗体的检测。IgG 是血清主要的抗体成分,约占血清Ig的75%,其中40~50%分布于血清中,其余分布在组织中。在5种免疫球蛋白中,IgG 生成的相对较晚,其持续时间也是最长的,免疫球蛋白是机体受抗原 (如病原体)刺激后产生的,其主要作用是与抗原起免疫反应,生成抗原-抗体复合物,从而阻断病原体对机体的危害,使病原体失去致病作用,在机体免疫中起到保护作用,能有效抵抗某些感染性疾病。外源性真菌侵入肺部,引起肺的局部的炎症反应,局部与整体互相影响,血清中烟曲霉IgG 抗体水平升高,提示患者烟曲霉菌感染,肺部真菌感染后不断刺激机体产生炎症反应,其IgG 抗体一直处于比较高的水平,其浓度也会持续很长一段时间。

与真菌抗原检测相比,真菌血清特异性抗体检测的研究和临床应用相对滞后,其主要原因是过去人们认为抗体检测的特异性较差,不能区分是体内定植还是感染;而机会性真菌感染常发生在机体免疫功能低下的人群,难以产生足够量的抗体,易发生假阴性[5]。但是近年来的研究表明,定植和感染的患者其特异性抗体水平存在显著差异;而存在免疫缺陷的患者也可以产生足够的抗体水平从而用于肺部真菌感染的诊断[6]。同时,随着人们对CPA认识的加深,真菌特异性抗体检测已经成为诊断的重要方法。血GM 试验广泛用于IPA 的诊断,但在CPA 患者中其阳性率不高。Shin等[7]对确诊为CPA 的168例患者进行研究,发现血GM 试验阳性率为23%,其敏感度为23%,特异度为85%,认为血GM 试验不能用于CPA 的血清学诊断。本研究中,CPA 患者治疗前后血清烟曲霉IgG 抗体阳性率的变化能显示CPA 的发生与发展进程,抗真菌治疗能够显著降低CPA 患者血清中烟曲霉IgG 的水平,但是对可疑阳性患者效果不明显 (表1),这和患者的临床症状减轻或消失相符。本研究显示,可疑阳性患者经抗真菌治疗后其烟曲霉IgG抗体水平与治疗前比较差异无统计学意义,以烟曲霉IgG 抗体滴度120 AU/ml为界,单独分析16例阳性治疗前后的情况,治疗后与治疗前差异有统计学意义 (P<0.05),显示抗真菌治疗对血清烟曲霉IgG 抗体滴度>120 AU/ml的患者显著,可疑阳性组没有明显效果,也就是说可疑阳性组患者抗真菌治疗效果不好,这类患者可用药也可不用。12例临床诊断烟曲霉菌感染患者抗真菌治疗后,临床症状较治疗前减轻,但是CPA 患者病程往往较长,病灶吸收缓慢,本研究12例临床诊断患者于3个月后复查肺CT,影像学结果显示仅有2例患者病灶较之前吸收缩小,其余10例病灶吸收无明显变化,本研究结果提示临床诊断烟曲霉感染患者的血清学结果优先于影像学结果。

本研究中烟曲霉特异性IgG 抗体水平一定程度上提示了疾病进展的程度,该试剂盒所测阳性患者血清烟曲霉IgG 阳性率的变化能够反映疾病的发生与发展进程。同时抗真菌治疗后,患者临床症状明显减轻,提示抗真菌治疗成功,其抗体水平也会相应降低,进一步证实烟曲霉特异性抗体检测在CPA 感染中的意义,为CPA 患者的早期临床诊断及疾病的进展有一个很好的提示作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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