仔猪断奶应激对肠道微生物菌群影响的研究

2019-08-20于光辉姜建阳张华杰宋春阳

中国兽医杂志 2019年4期

于光辉，姜建阳，张华杰，耿梅，宋春阳

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109；2.威海市动物疾病控制预防中心,山东威海264200)

断奶仔猪由于消化系统和免疫系统等生理机能发育不够完善,消化酶及胃酸分泌不足,肠道内微生物区系尚未建立,体温调节能力差[1],导致仔猪在断奶时会表现出一系列的症状,如食欲减退、消化力差、腹泻、抵抗力差、易被病原微生物侵袭等,从而造成消化不良、体弱、生长发育受阻、饲料报酬低等断奶应激综合征[2]。断奶应激是猪生产中的一个普遍现象,给养猪业造成巨大的经济损失。

寄居在动物肠道中的细菌对于维持寄主的健康发挥着重要的作用,肠道微生物菌落能够帮助寄主消化吸收营养物质、提高免疫力、维持上皮细胞发育,并且是抵御外源致病菌的天然屏障[3]。当然,肠道微生物也有不利的方面,它能通过与遗传距离较远的致病菌以等位基因交换的方式,或者整合几种致病菌的致病基因变为新的致病菌[4-5]。断奶应激和日粮改变会打破微生态的平衡,导致乳酸菌减少,大肠杆菌增多,而多数人认为仔猪断奶后腹泻的主要致病菌就是大肠杆菌[6]。乳酸杆菌与肠杆菌的比例通常被用于评价肠道的健康水平,比值增加说明肠道健康,断奶导致比值下降,仔猪肠道健康受到威胁引发腹泻甚至死亡,仔猪断奶后抑制肠道菌能够预防或者降低腹泻的程度[7]。

众所周知,中国地方品种猪经过几千年的遗传进化,有着丰富的遗传多样性,有很多优良性状是引进品种猪所不具备的,它们更能适应当地的气候环境,并且比国外品种有独特的抗逆性,肠道微生物菌群相对稳定,断奶应激反应相对较小。本研究以莱芜猪和杜-长-大仔猪为研究对象,比较两品种仔猪断奶前后肠道微生物的变化情况,为猪的抗逆性状选育和微生态制剂的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物试验选择同一日龄出生的健康杜-长-大仔猪和莱芜猪各10 头(来自同一窝)作为试验动物。

1.2 试验设计两品种仔猪均于28 日龄断奶,每个品种为1 个处理组,根据断奶时间分为5 个阶段,分别是断奶前1 周(21 d)、断奶当天(28 d)、断奶后1 d(29 d)、断奶后1 周(35 d)及断奶后2 周(42 d),每个处理组每个阶段随机选取2 头仔猪屠宰取样。

1.3 试验日粮仔猪出生5 d 开始补饲通威-200乳猪教槽料,所有试验猪在相同的环境下采用相同的饲喂方式。

1.4 饲养管理猪的饲养试验在青岛农业大学即墨段泊岚学生教学实习基地进行,仔猪出生第2 天补铁,第5 天开始补饲,第28 天时断奶,仔猪断奶后转入保育舍仍饲喂1 周的教槽料,以后逐渐过渡饲喂保育料,每天更换20%,整个试验期仔猪自由采食和饮水。

1.5 样品采集每个阶段试验结束时,两个品种各选取2 头体重相近的仔猪,当日清晨9:00 将其颈静脉放血致死,打开腹腔立即结扎幽门瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止消化道样品的相互污染。迅速找到空肠后端,取出50 g 左右的食糜,立即放入液氮速冻,然后移入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.6 试验方法

1.6.1 肠道微生物DNA 提取采集肠道内容物(200 mg 左右)保存在3 mL 无水乙醇中,提取DNA前用13 000 r/min 离心5 min,肠道微生物DNA 从离心沉淀中提取,用商业化生产的QIAamp DNA Stool Mini Kit(Cat.51504,德国)试剂盒,所有步骤均按照说明书进行操作。每个阶段同一品种的两头仔猪取等量的DNA 进行混合,为后续试验提供材料。

1.6.2 16S rDNA V3 区PCR 扩增采用Touchdown PCR 对细菌16S rDNA 的V3 区进行扩增,扩增引物如下:341 fGC:(5′-GCC GCC CGC CGC GCG CGG CGG GCG GGG CGG GGG CAC GGG GGG CCT ACG GAG GCA GCA G-3′),518 r:(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)其中GC 夹子为CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G,扩增体系为50 μL,阳性对照用ddH2O 做模板。Touchdown PCR 扩增条件:95 ℃5 min,94 ℃30 s,58 ℃30 s(每个循环降低0.5 ℃),72 ℃30 s,10 个循环的降落PCR 扩增完成后取5 μL 扩增引物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.6.3 DGGE 凝胶电泳 DGGE 用采用6%聚丙烯酰胺凝胶,分离细菌16S rDNA 的V3 可变区片段,浓度梯度为38%～50%。DGGE 电泳程序为:首先在200 V 电压条件下,电泳10 min,随后在85 V 固定电压、60 ℃的0.5x TAB 缓冲液(20 mmol/L Tris、10 mmol/L乙酸和0.5 mmol/L EDTA,pH 值7.5)中电泳16 h。电泳结束后,采用AgNO3染法进行染色。曝光照相后,对一些亮的条带进行切胶回收DNA 片段,克隆测序后在NCBI 网站进行BLAST 比对,鉴定细菌的类型。

1.6.4 荧光定量PCR 检测菌群表达量空肠中双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌的菌群数量用Q-PCR(SYBR Premix Ex TaqTM,TaKaRa 公司,宝生物工程(大连)有限公司)检测,引物参照Han,et al.(2013)的进行,详见表1。各细菌的反应程序为:95 ℃15 s,60 ℃1 min,72 ℃45 s,87 ℃5 s 共40个循环,以72 ℃10 min 延伸后结束。扩增和检测DNA 的荧光定量PCR 用ABI 7900 仪器,反应体系包括上下游引物各0.75 μL,Plus 12.5 μL,Tap 酶2 μL,Dye 0.5 μL,H2O 8.5 μL。

表1 荧光定量PCR 检测3 种细菌的引物信息

1.7 统计与分析两品种猪在不同阶段的数据分析用SAS 9.4 软件GLM 过程进行方差分析(SAS Inst.Inc.,Cary,NC),菌群的Q-PCR 每个样本8 个重复,选择5 个平行较好的数值进行-△△t 统计分析,数据表示为平均值。PCR-DGGE 指纹图谱用Quantity One(BIO-RAD,CA)和Biodap 软件计算菌群的丰度、Shannon-Wiener 指数和均匀度。

2 结果与分析

2.1 DGGE 检测肠道微生物两品种仔猪断奶前后不同阶段肠道微生物DGGE 检测结果见图4,断奶前1 周两品种猪的微生物菌群丰度差异不明显(a和b 泳道),但是断奶后1 d 比断奶前1 周微生物复杂(c 和d 泳道),并且莱芜猪比杜-长-大仔猪更复杂些。菌群的复杂程度在断奶后1 周逐渐降低(e和f 泳道),并且莱芜猪的仍然比杜-长-大的要复杂。优势菌群的菌落在断奶后1 周比断奶前1 周和断奶后1 d 都有所改变。两品种仔猪菌群在断奶后2 周都下降(g 和h 泳道),并且优势菌群也不尽相同。

图1 DGGE 测定两品种仔猪断奶前后空肠微生物菌群

2.2 肠道微生物菌群分析空肠肠道微生物香农-维纳指数和丰度信息见表2,总体来看两品种之间微生物菌群多样性的差别是比较明显的,在各个阶段莱芜猪比杜-长-大仔猪有更多的菌群数,菌群多样性在断奶后1 d 还是比较丰富的,断奶后的前2周菌群相对较少,以后逐渐趋于平衡。对优势菌群切胶测序比对发现,双歧杆菌在各个时期都比较丰富(图1,箭头5),产肠毒素大肠杆菌仅在断奶后出现,断奶后1 d 迅速增殖,并且成为肠道中的优势菌群(图1,箭头7)。乳酸杆菌作为动物健康的有益菌,在仔猪肠道中并不是优势菌群,DGGE 只能在两品种仔猪断奶前和莱芜猪断奶后1 d 检测到(图1,箭头1),肠杆菌和肠球菌在各个时期都是肠道优势菌群(图1,箭头4 和10)。

表2 空肠菌群的丰度、香农-维纳指数和均匀度信息

2.3 荧光定量PCR 检测肠道菌群双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌是动物肠道中常见的几种优势菌群,Q-PCR 检测这3 种菌群的相对含量(图2)。

由图2 可见,莱芜猪的双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌在断奶前后各个时期变化是逐渐过渡,比较平缓,但是在杜-长-大仔猪肠道中变化幅度比较大。两品种仔猪在断奶前1 周、断奶后1 d 和断奶后2周的双歧杆菌差异不显著(P ＞0.05),但是在断奶后1 周莱芜猪是杜-长-大仔猪的6.4 倍(P ＜0.01)。对于乳酸杆菌在断奶前1 周和断奶后1 周杜-长-大仔猪是莱芜猪2 倍左右(P ＜0.01),但是在其他时期两品种仔猪之间差异不显著(P ＞0.05)。莱芜猪比杜-长-大仔猪的大肠杆菌在各个时期都相对较低,杜-长-大仔猪断奶后1 周空肠大肠杆菌比莱芜猪高87%(P ＜0.05)。

3 讨论

肠道微生态平衡对动物的健康至关重要,在养猪生产中,断奶必然改变肠道微生物菌群平衡,仔猪断奶应激会打破微生态平衡,导致乳酸菌等有益菌减少,而大肠杆菌增加,引发大肠杆菌性腹泻。荧光定量PCR 是检测肠道菌群相对含量的有效方法[8-9],本试验定量检测了双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌在不同断奶期的相对含量,在不同的断奶期会有相应的变化,与其他人的研究结果相似[10-11]。用DGGE 的方法只能在两品种仔猪的断奶前1 周和莱芜猪断奶后1 d 检测到乳酸菌,但是通过特异引物荧光定量PCR 却可以在其他时期检测到。另外,令人疑惑的是乳酸菌在杜-长-大仔猪断奶后1 周是优势菌群,但是在断奶后2 周急剧下降。

图2 两品种仔猪断奶前后双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌相对含量

大肠杆菌不仅影响猪的肠道生理状态,而且影响其免疫应答。有些饲料添加剂通过干扰肠道微生物种群来缓解仔猪断奶应激,例如低聚甘露糖,它是一种从酵母菌中提取的细胞壁成分,它能够干扰细菌与上皮细胞的结合,调节肠道微生物系统,降低肠道致病菌繁殖[8],提高动物的免疫力。氧化锌可以通过降低大肠杆菌种系的多样性来增加肠道微生物菌群的稳定性[6]。

pH 值是动物体内消化环境的重要因素,适宜的酸碱环境是营养物质充分消化吸收、有益菌群合理生长、病原微生物受到有效抑制的必要条件[12]。仔猪出生后,胃内pH 值随着体重的增加而呈现下降的趋势；仔猪断奶后,消化道内的pH 值会显著升高,高于断奶前的pH 值[13]。消化道pH 值升高,不仅会对肠道消化酶活性产生影响,还会导致肠道菌群紊乱,病原菌大量增殖,特别是大肠杆菌,引起仔猪腹泻[10]。由于断奶后胃和十二指肠pH 值明显升高,使胃蛋白酶活性降低,对饲料的消化吸收能力减弱,引发食欲不振、腹泻等问题[14]。另外,酸碱度会影响细胞生长,酸度增加可促进细胞分裂,加快肠黏膜的修复[15](Godlewski,et al.2009)。