福建省谱系3 PRRSV 的分离及其ORF5 基因序列分析

魏春华，夏 伟，李 娜，马 英，吴熠丹，虞慧云，戴爱玲，杨小燕，刘建奎

(龙岩学院生命科学学院 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建省生猪疫病防控工程技术研究中心,福建 龙岩364000)

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种具有高度传染性的繁殖障碍和呼吸道疾病,该病自1987 年在美国首次报道以来,相继在全世界范围暴发,给世界养猪业造成巨大的经济损失[1-4]。

PRRSV 基因组为不分节段,有囊膜的单股正链RNA 病毒,基因组长约15 kb,含有至少10 个开放阅读框架(ORF)[5-7]。PRRSV 基因组存在高度的变异,Nsp2、ORF3、ORF5a 和ORF5 基因高度变异,ORF5 基因的变异情况在很大程度上可以反映PRRS 基因组的遗传变异特征,因此国内外研究人员常以其作为靶基因研究毒株的遗传变异[8-11]。ORF5 基因所编码的GP5 蛋白是PRRSV 主要的中和抗原和结构蛋白之一,其良好的免疫原性能够诱导机体产生中和抗体和细胞免疫反应,是研制PRRS 基因工程疫苗的首选。Shi 等(2010)收集8624 株ORF5 基因构建遗传进化树,结果显示,PRRSV 可分为9 个谱系(lineage),每个谱系的毒株又可划分为不同的亚型,呈现出PRRSV 遗传多样性[11]。我国2006 年暴发的HP-PRRSV 处于lineage 8.7,2013 年爆发的NADC30-like PRRSV 处于lineage 1。此外,我国PRRSV 还存在lineage 3(QYYZlike PRRSV)和lineage 5.1(VR-2332 like PRRSV)两个谱系的毒株。

本试验从福建地区采集的病料样本中分离到1株PRRSV,通过RT-PCR、间接免疫荧光和ORF5 基因序列测定对其进行鉴定,同时测定了其在Marc-145 细胞上的TCID50,证实分离毒株FJFQ1805 为谱系3 的毒株。

1 材料与方法

1.1 猪场发病情况及样品采集 2018 年4 月,福建省福州市某猪场疑似PRRS 感染,该场病猪临床表现为食欲减退、精神不振,体温升高(40 ℃～41 ℃),呼吸困难,耳朵、下腹发绀,妊娠母猪流产、早产、死胎。剖检可见肺间质增宽,颌下、肺门、腹股沟等部位淋巴结等不同程度肿胀、充血。无菌采集病猪的肺脏、淋巴结等组织置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂 DNA Marker 2 000、Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、Recombinant RNase Inhibitor(40 U/μL)、Reverse Transcriptase M-MLV 反转录酶(200 U/μL),购自宝生物工程(大连)有限公司；RNA 提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗鼠lgG 荧光抗体(FITC 标记)为美国Sigma 公司产品。

1.3 引物设计 按照参考文献[12]方法设计欧洲型PRRSV ORF5 引物,引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成,扩增目的片段的大小约为700 bp。

1.4 病料的处理 将无菌采集病猪的肺脏、淋巴结等组织剪碎,充分研磨,反复冻融3 次,离心后取上清液备用。

1.5 病毒分离 将处理过的病料上清液接种于长满单层的Marc-145 细胞,PBS 洗涤后加入适量的DMEM 维持溶液,于37 ℃恒温条件下的CO2培养箱中培养,每天观察细胞病变(CPE)。当细胞变圆、皱缩、细胞核固缩脱落时达到80%以上时收毒,反复冰冻融解数次。以3 000 r/min 离心10 min 后,取上清液并储存在-70 ℃。

1.6 分离病毒的间接免疫荧光(IFA)检测 PRRSV接种到长成单层的Marc-145 细胞的培养板中,37 ℃吸附1 h 后弃接种液,PBS 清洗后,加入适量的DMEM 维持液于每孔中,置于培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养48 h,设正常细胞作对照。细胞出现病变后,利用冷的甲醇固定法进行固定,20 min 后弃固定液,PBS 清洗3 次,后每孔加入200 μL 稀释的PRRSV N 蛋白鼠源单克隆抗体(MAb,1∶800),37 ℃作用2 h,PBS 轻柔的清洗3 次,将稀释后的FITC-羊抗鼠IgG 加入每孔中,在37 ℃条件下放置1 h,PBS 清洗3次,待其干燥后倒置在荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.7 TCID50的测定 将DMEM 培养基10 倍梯度稀释的第4 代病毒(10-1～10-10)接种至已长成单层Marc-145 细胞的96 孔细胞培养板,每孔100 μL,每个梯度做4 个重复,37 ℃吸附1 h,弃去病毒液,每孔加入100 μL 维持液,置于37 ℃5%CO2继续培养6 d,每天观察并记录CPE,根据Reed-Muench 方法计算TCID50。

1.8 分离病毒的ORF5 基因的RT-PCR 扩增及序列分析 病毒液RNA 的提取按照RNAsimple Total RNA Kit 抽提试剂盒说明书进行。按照说明书制备其cDNA,以其为模板进行ORF5 基因的PCR 扩增。PCR 扩增程序为:95 ℃4 min；94 ℃45 s、55 ℃45 s、72 ℃45 s,35 个循环；72 ℃10 min,同时设不加模板的阴性对照。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 扩增产物回收纯化后克隆至pMD19-T 载体上,鉴定为阳性的重组菌由北京睿博兴科生物技术有限公司测序。 采用DNAStar Lasergene 7.1 程序中的CLUSTAL W 程序对ORF5 基因进行多序列比对。用MEGA 6.0 软件中的邻近法(Neighbor-joining tree with 10,00 bootstrap)对ORF5 基因进行遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 病毒接种细胞 将采集的病料样品处理后接种Marc-145 细胞后5 d 后细胞出现聚集成丛、变圆、脱落等典型的CPE,表明分离株能够在Marc-145 细胞上增殖(见中插彩版图1)。

2.2 PRRSV 的间接免疫荧光鉴定结果 对分离获得的病毒采用PRRSV N 蛋白MAb 进行间接免疫荧光检测,结果显示,被感染的细胞可以被抗PRRSV的特异性单抗所识别,被感染的细胞有特异性的荧光(见中插彩版图2)。表明成功分离到了PRRSV,将分离的病毒株命名为FJFQ1805。

2.3 RT-PCR 扩增结果 分离的病毒接种细胞后经RT-PCR 扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示,获得了约为700 bp 目的片段,与预期相符(图3),表明已经成功分离PRRSV。

图3 PRRSV ORF5 基因PCR 扩增结果

2.4 PRRSV 分离株TCID50的测定 将10 倍梯度稀释后的分离株FJFQ1805 的第4 代接种长满单层Marc-145 细胞的96 孔细胞培养板,按照Reed-Muench 法计算得到该分离株的TICD50为105.3。

2.5 ORF5 基因及推导氨基酸序列的变异分析测序结果显示,FJFQ1805 ORF5 基因核苷酸长度为603 bp,编码200 aa。通过DNAStar Lasergene 软件对所测序列进行比对分析,结果显示,分离株FJFQ1805 ORF5 基因与参考毒株典毒株VR2332、CH-1a 和BJ-4 的核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为83.9%～85.9%和81.0%～83.6%；与TJ、HuN4 和JXA1 等HP-PRRSV 的核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为85.1%和82.5 ～82.6%；与NADC30、CHsx1401 株和FJZ03 的核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为84.2%～85.6%和83.0%～85.5%；与FJFS、GM2 和QYYZ 等谱系3中PRRSV 的核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为91.5%～92.2%和90.5%～92.0%；而与欧洲代表毒株LV 的核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别62.6%和55.1%。 结果表明,所分离的FJFQ1805 毒株为新流行的谱系3 的毒株。

2.6 ORF5 基因的遗传进化树分析 基于ORF5 遗传进化分析,可将北美型PRRSV 分为4 个谱系,即以VR2332、BJ-4 为代表的谱系5.1,以CH-1a、JXwn06、JXAl 和HUN4 等为代表的谱系8.7,以NADC30、CHsx1401、FJZ03 等为代表的谱系1,以及以GM2、QYYZ 和FJFS 为代表的谱系3(图4)。构建遗传进化树显示,分离株FJFQ1805 与福建毒株FJFS 及广东分离株QYYZ 和GM2 亲缘关系较近,处于同一进化分支,而与谱系8.7、谱系5.1 和谱系1 的代表毒株处于不同的进化分支,亲缘关系远。由此表明,分离株FJFQ1805 毒株为谱系3 毒株(图4)。

图4 FJFQ1805 毒株与参考毒株ORF5 基因序列系统进化树分析

2.7 ORF5 基因编码的氨基酸序列分析 利用DNAStar Lasergene 软件中的Megalign 程序,将所测的PRRSV GP5 序列与国内外常用的参考毒株进行序列比对分析,结果显示,ORF5 基因编码的氨基酸存在多处的突变,其中变异程度最大的区域为信号肽区域(aa1 ～aa25),除此之外还存在多处散在的氨基酸变异位点。GP5 蛋白胞外区aa37 ～aa45(S37H(L/F)QLIYNL45)是PRRSV 主要的中和抗原表位[13-15],其中H38和I42YN44被认为是PRRSV 中和表位的识别位点,L/F39QL41被认为是PRRSV 中和表位的结合位点[14-15]。 谱系3 中的毒株FJFS、QYYZ、GM2 和FJFQ1805 存在H38→Y38和L39→S39的变异(图5)。PRRSV GP5 蛋白有两个位点(R13和R151)被认为是潜在的病毒毒力相关位点。FJFQ1805 毒株存 在R13→Q13和R151→K151的 变 异。与HP-PRRSV、VR2332、NADC30 和CH-1a 相比,FJFS、QYYZ、GM2 和FJFQ1805 在第25(F/L25→S25)、26(A26→I26)、38(H38→Y38)、66(S/T66→C66)、92(A/G92→S92)、117(L117→F117)、199(R199→H199)位氨基酸发生了特征性的突变(图5),表明谱系3的毒株与其他谱系的毒株相比发生了较大程度的变异。

图5 PRRSV GP5 序列分析

3 讨论

PRRS 已成为严重危害养猪业的重要疫病之一,我国自1996 年开始流行PRRS,给我国养猪业造成巨大危害,2006 年在我国南爆发的HP-PRRS,迅速蔓延至全国各地并成为我国的优势毒株。2013年福建省开始流行NADC30-like PRRSV,为猪场防控PRRS 带来严峻挑战,2017 年lineage 3 PRRSV 呈现小范围流行,进一步加剧了PRRS 的防控难度[16]。

本试验对分离株FJFQ1805 和12 株参考毒株的GP5 同源性进行分析,结果显示,FJFQ1805 与经典株(VR2332、CH-1a、BJ-4)氨基酸同源性为81.0%～83.6%；与高致病性毒株(HuN4、JXA1、TJ)氨基酸同源性为82.5%～82.6%；与NADC30-like PRRSV(NADC30、FJZ03、CHsx1401)氨基酸同源性为83.0%～85.5%；与谱系3 的毒株QYYZ、GM2 和FJFS 氨基酸同源性最高为90.5% ～92.0%。系统进化树分析结果显示,分离株FJFQ1805 和谱系3 中的毒株FJFS、QYYZ 和GM2处于同一进化分支,亲缘关系较近,而与经典毒株、HP-PRRSV 和NADC30-like PRRSV 处于不同进化分支,亲缘关系较远,表明分离株FJFQ1805为谱系3 的毒株。

GP5 蛋白是PRRSV 的重要的结构蛋白之一,具有的良好的抗原性,可诱导机体产生中和病毒的中和抗体,而高变异的GP5 可能会影响机体抗GP5 抗体效价和交叉保护率[17-18]。与HP-PRRSV、VR2332 和CH-1a 相比,谱系3 中的毒株FJFQ1805、QYYZ、GM2 和FJFS 在第25(F/L25→S25)、26(A26→I26)、38(H38→Y38)、66(S/T66→C66)、92(A/G92→S92)、117(L117→F117)和199(R199→H199)位氨基酸发生了特征性的突变,尤其在中和表位B(S37H(L/F)QLIYNL45)存在H38→Y38和L/F39→S39的变异,这些变异可能会导致GP5 蛋白抗原性发生变化,并影响病毒与中和抗体有效的识别,从而导致病毒逃逸机体免疫应答,造成免疫失败。

目前谱系3 的毒株在福建省呈现小范围流行,但是该类毒株出现时间较短,病毒的来源、致病性、生物学特性等尚且不清楚,因此应当加强对该类毒株的防控,尤其是对跨地区引种或生猪贸易,应加强检疫和生物安全,避免猪场引入新的毒株。谱系3 的毒株与现有的疫苗株RespPRRSV MLV 和HPPRRSV 疫苗株处于不同遗传分支,亲缘关系较远,现有的弱毒疫苗是否能对其起到良好的免疫保护作用需要进一步研究。