姜黄素对胰腺癌细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究Δ

庞慧芳，范学科，满 泉，李 鹏

(1.通辽市医院消化内镜中心，内蒙古 通辽 028000； 2.晋城市人民医院消化内科，山西 晋城 048000； 3.首都医科大学附属北京友谊医院消化内科，北京 100050)

胰腺癌是一种起病隐匿、发展迅速且病死率较高的恶性肿瘤，其早期诊断困难，治疗效果不佳[1]。近年来，各种体内体外研究结果表明，姜黄素可以抑制包括胰腺癌在内的多种肿瘤细胞的生长，其主要通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，促进肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤效应[2-9]。但是，姜黄素诱导胰腺癌细胞凋亡的机制尚不完全清楚。本研究以不同浓度姜黄素处理胰腺癌PANC-1细胞，观察姜黄素对该细胞增殖与凋亡的影响，进一步检测凋亡相关基因含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9及B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax)的表达变化，探讨姜黄素对胰腺癌的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞株PANC-1细胞(同济医院肝病研究所提供)；RPMI-1640高糖培养基(美国Gibco公司)；姜黄素(纯度>95%)(美国Sigma公司)；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)(武汉鼎国生物公司)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物有限公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；Real-time PCR逆转录试剂盒、SYBR Green Real-time PCR Master Mix(日本Takara公司)，PCR引物(上海生工合成)；Western凝胶试剂盒(武汉博士德生物公司)；Caspase-3、Caspase-9兔抗人单克隆抗体(美国Proteintech公司)；β-肌动蛋白兔抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(武汉谷歌生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响：(1)取对数生长期的人胰腺癌PANC-1细胞，用0.25%胰酶消化后，制成5×104个/ml单细胞悬液，以每孔200 μl细胞悬液接种于96孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱培养。(2)经培养24 h贴壁达70%融合度时，弃掉旧培养基，分别设实验组、阴性对照组、空白组0和空白组1。实验组用10、20、40、60、80、100 μmol/L浓度的姜黄素处理；阴性对照组为单纯培养基处理；空白组0为未接种细胞的单纯培养基；另设相应浓度姜黄素的培养基为空白组1。以上每孔均设4个平行复孔，体积调整为100 μl，于37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24、48和72 h。(3)实验终止后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，轻轻摇晃混匀后用锡箔纸包裹培养板，放入培养箱继续培养2 h，用酶标仪于450 nm波长检测各孔光密度(OD)值。(4)计算人胰腺癌PANC-1细胞各实验组相对增殖率，分析药物浓度和处理时间对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响。细胞相对增殖率=(实验组OD值-空白组1 OD值)/(阴性对照组OD值-空白组0 OD值)×100%。

1.2.2 流式细胞仪检测姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响：(1)将PANC-1细胞以3×105/每孔接种于6孔板。(2)细胞贴壁达80%融合度时经0、10、20、40 μmol/L浓度的姜黄素处理，设3个复孔，48 h后用倒置相差显微镜观察细胞凋亡情况并拍照记录。(3)收集并胰酶消化，1 000 r/min离心5 min后再用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞2次，1 000 r/min离心5 min，弃上清并收集2×105个细胞。(4)加入 1×Binding Buffer悬浮细胞500 μl后，先后加入Annexin V-FITC 5 μl及碘化丙碇5 μl混匀。(5)室温(24～26 ℃)、避光及反应10 min后，在1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3 实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测姜黄素对Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bax的信使RNA(mRNA)表达变化的影响：(1)将人胰腺癌PANC-1细胞以每孔3×105接种于6孔板，融合度达80%时，用0、10、20、40 μmol/L浓度的姜黄素处理，继续培养48 h后使用Trizol法提取细胞总RNA并测定浓度。(2)采用TaKaRa逆转录试剂盒将RNA逆转录为互补DNA(cDNA)，使用SYBR Green试剂盒配制聚合酶链反应液，在StepOne Real-time PCR systems(ABI，USA)上按反应条件进行RT-PCR反应。每组设3个复孔，设β-肌动蛋白为内参。用2-ΔΔCT法计算分析RT-PCR数据，比较各组基因表达的相对差异。

1.2.4 蛋白质印迹法(Western Blot法)检测姜黄素对Caspase-3、Caspase-9蛋白表达变化的影响：(1)将人胰腺癌PANC-1细胞以每孔3×105接种6孔板，用0、10、40 μmol/L姜黄素处理48 h后提取细胞总蛋白。(2)测定蛋白浓度并常规变性处理，进行电泳、转膜、孵育一抗Caspase-3、Caspase-9、β-肌动蛋白与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。(3)增强化学发光法显色后，用BioDoc-It 220凝胶成像系统和Image J分析软件对图像条带作半定量分析，并比较各组蛋白表达变化。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响

CCK-8法结果显示，随着姜黄素作用浓度的逐渐提高，人胰腺癌PANC-1细胞增殖率逐渐降低；并且，随着处理时间的延长，其增殖抑制效应更加显著，上述差异均具有统计学意义(P<0.05)，说明姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞具有较强的增殖抑制作用，且呈剂量和时间依赖性，见表1、图1。

表1 姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞相对增殖率的影响Tab 1 Effect of curcumin on the relative proliferation rate of pancreatic cancer PANC-1

注：与对照组比较，*P<0.05；与24 h组比较，▲P<0.05；与48 h组比较，#P<0.05

Note:vs. control group,*P<0.05; vs. 24 h group,▲P<0.05; vs. 48 h group,#P<0.05

图1 姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞相对增殖率的影响Fig 1 Effect of curcumin on the relative proliferation rate of pancreatic cancer PANC-1 cells

2.2 姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，实验组经姜黄素处理的人胰腺癌PANC-1细胞的凋亡率显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2(A—B)；并且，当姜黄素浓度在0～20 μmol/L时，随着浓度增高，细胞凋亡率逐渐升高，但当浓度达40 μmol/L时细胞凋亡率反而降低，细胞坏死率却显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，但正常细胞总数仍最低。这说明姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞不仅具有促进凋亡作用，而且具有一定的细胞毒性作用。倒置相差显微镜下，随着姜黄素浓度的增加，人胰腺癌PANC-1细胞的凋亡现象更加显著。与对照组比较，姜黄素40 μmol/L组细胞总数大量减少，并出现细胞皱缩且体积变小，细胞变圆，细胞间的紧密连接变得松散，上清液中可见大量漂浮的凋亡细胞，发生典型的细胞凋亡现象，即出现凋亡小体，见图2(C)。

表2 姜黄素对胰腺癌PANC-1细胞凋亡率的影响Tab 2 Effect of curcumin on the apoptosis rate of pancreatic

注：与对照组比较，*P<0.05，#P>0.05

Note: vs. control group,*P<0.05,#P>0.05

A.PANC-1细胞分布经0、10、20及40 μmol/L姜黄色处理48 h后流式细胞仪检测图；B.PANC-1细胞凋亡率及坏死率的变化(与对照组比较，*P<0.05，#P>0.05)；C.40 μmol/L姜黄素处理PANC-1细胞48 h后相差显微镜下凋亡形态学变化(×200)A.flow cytometry of PANC-1 cells distribution after processing by 0, 10, 20 and 40 μmol/L of curcumin for 48 hours; B.changes of apoptosis rate and necrosis rate of PANC-1 (vs. control group, *P<0.05, #P>0.05); C.morphological changes of apoptosis of PANC-1 cells under phase contrast microscope after processing by 40 μmol/L of curcumin for 48 hours (×200)图2 姜黄素对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响Fig 2 Effect of curcumin on the apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells

2.3 姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡相关基因表达的影响

2.3.1 人胰腺癌PANC-1细胞Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8及Bax的mRNA表达变化：RT-PCR法结果显示，实验组人胰腺癌PANC-1细胞Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表达水平较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着姜黄素浓度增高，其表达量具有递增趋势(F=1 960.106，P=0.000；F=1 938.118，P=0.000)；Caspase-8及Bax基因mRNA表达水平在姜黄素浓度为0～20 μmol/L时具有递增趋势，但在40 μmol/L时反而降低接近基础水平；Bax基因mRNA表达水平的组间差异有统计学意义(F=24.796，P=0.000)；姜黄素浓度为10、20 μmol/L时，Caspase-8基因mRNA表达水平的差异有统计学意义(F=95.212，P=0.000)，姜黄素浓度为40 μmol/L时与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)，见图3(A)。

2.3.2 人胰腺癌PANC-1细胞Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达变化：Western blot法结果显示，与对照组比较，实验组人胰腺癌PANC-1细胞Caspase-3、Caspase-9基因的蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)(F=50.790，P=0.000；F=399.717，P=0.000)；姜黄素浓度达到40 μmol/L时，Caspase-3基因的蛋白表达则无明显升高趋势，与20 μmol/L时的差异无统计学意义(P>0.05)，这与mRNA水平并不完全相符；Caspase-9蛋白水平的升高趋势较显著，实验组各浓度组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，基本符合该基因的转录水平变化，见图3(B—C)。

A.Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8及Bax的mRNA表达变化(与对照组比较，*P<0.05，#P>0.05)；B.Caspase-3、Caspase-9的蛋白条带图；C.Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达变化(与对照组比较，*P<0.05)A.changes of mRNA expressions of Caspase-3, Caspase-9,Caspase-8 and Bax (vs. control group, *P<0.05, #P>0.05); B.histogram of protein of Caspase-3 and Caspase-9; C.changes of protein expression of Caspase-3 and Caspase-9 (vs. control group, *P<0.05)图3 姜黄素对胰腺癌PANC-1细胞凋亡相关基因表达的影响Fig 3 Effect of curcumin on the expression of apoptosis-related gene in pancreatic cancer PANC-1 cells

3 讨论

姜黄素为一种天然多酚类化合物，其预防肿瘤、抗肿瘤及增强恶性肿瘤放化疗敏感性的作用在多种肿瘤细胞中得到了证实[10-11]。本实验选用中药姜黄素为研究对象，观察该药对体外培养的人胰腺癌PANC-1细胞的抗肿瘤效应。本研究结果显示，姜黄素能够显著抑制人胰腺癌PANC-1细胞的增殖，促进其凋亡，二者均呈剂量依赖性(P<0.05)；经姜黄素处理的实验组细胞镜下可见皱缩变圆、体积变小，发生典型的凋亡形态学改变。该结果与国内外相关研究结果基本一致[12-14]。与对照组比较，虽然实验组人胰腺癌PANC-1细胞的凋亡率及坏死率明显升高，但当姜黄素浓度提高至40 μmol/L时其凋亡率降低，坏死率却显著升高，活细胞率仍最低。这说明姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞不仅具有促进凋亡作用，还具有一定程度的细胞毒性杀伤作用。

为进一步阐明姜黄素诱导人胰腺癌PANC-1细胞的凋亡机制，本研究采用RT-PCR法，从RNA水平检测姜黄素对人胰腺癌PANC-1细胞凋亡关键因子Caspase家族及Bax基因的表达变化。结果提示，实验组各姜黄素浓度组细胞的Caspase-3、Caspase-9基因mRNA表达水平较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，且随着姜黄素浓度增高其表达量具有递增趋势。该结果表明，姜黄素对人胰腺癌细胞的凋亡机制主要通过诱导Caspases家族基因而介导，其中内源性途径占主导地位。另外，内源性凋亡途径主要受B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白调控，Bax是Bcl-2家族中最重要的促凋亡因子。本研究中，姜黄素能够上调Bax mRNA的表达。因此，姜黄素对体外胰腺癌细胞通过抑制其增殖和促进其凋亡而起到抗肿瘤效应，其促凋亡的分子机制主要通过凋亡执行蛋白Caspases家族基因与凋亡调控蛋白Bcl-2家族的调节而介导。总之，姜黄素可能通过内源、外源2条途径激活Caspases家族基因而诱导人胰腺癌细胞凋亡，但以内源性凋亡途径为主导，二者相互影响，相互作用。