白茶水提物通过诱导凋亡抑制肝癌细胞BEL-7402增殖

刘博，黄嘉璐，刘立跃

福建省宁德师范学院生命科学学院，352100

白茶（White tea, WT） 是我国的一种特种茶，主要产于福建省福鼎、政和、松溪和建阳等县，其中福鼎是世界白茶的发源地，也是中国白茶的主要出口基地。白茶是一种微发酵茶，其加工工艺简单，只包括萎凋和干燥两道工序，既不破坏酶的活性，又不促进氧化作用，因其成品茶多为芽头，满披白毫而得名。白茶不仅具有其他茶类含有的茶多酚、儿茶素、维生素、生物碱、氨基酸及挥发性物质等成分[1-2]，而且其茶多酚和儿茶素等有效成分的含量均高于红茶和黑茶等发酵茶类[3-4]。白茶和绿茶中的各有效成分含量相近，两者都具有较高含量的儿茶素，儿茶素是茶类发挥保健作用的主要活性成分，因而普遍认为这两类茶具有更好的保健作用[5-6]。

国内外已有的研究表明，不同类别的茶叶（包括白茶、红茶、乌龙茶、绿茶）、不同茶叶组分（如热水提取液、茶多酚化合物等）对多种肿瘤（肺癌、胃癌、皮肤癌、乳腺癌、肝癌和食道癌等）均有抑制作用[7-8]。阻碍肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡是绿茶及其提取物抑制肿瘤生长的重要途径[9-10]。然而，有关白茶对肿瘤细胞抑制作用的研究还很少，白茶或其提取物是如何抑制肿瘤细胞增殖的问题有待研究。

本研究以肝癌细胞BEL-7402 株为试验对象，以 白 茶 水 提 物 （White tea aqueous extract, WTAE）为研究材料，采用DAPI 染色法、TUNEL 法和Caspase-3 活性检测法等探究WTAE能否导致肿瘤细胞凋亡；利用Real-time PCR法检测细胞内凋亡相关基因的表达水平。

一、材料与方法

1.试验材料

BEL-7402 细胞购自ATCC 在中国的代理公司；1640培养液为GIBCO公司生产；胎牛血清购自杭州四季青公司；双抗（青霉素和链霉素）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DAPI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒均购自江苏碧云天生物技术有限公司；TRIzol购自TaKaRa公司；Real-time PCR 试剂盒购自Thermo 公司；反转录试剂盒购自Fermentas 公司；各儿茶素组分等的标准品购自中国药品生物制品检定所。

2.白茶水提物的准备

白茶（白毫银针）购自宁德市福鼎某茶叶公司。将2 g 白茶粉放入56℃的100 mL 去离子水中浸泡1 h；取茶汤经孔径为0.45 μm 的滤器过滤后冻干备用。

3.白茶水提物成分分析

采用液相色谱法检测白茶水提物和白茶中咖啡碱、没食子酸（GA）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和儿茶素没食子酸酯（CG）等成分的含量。具体方法参照国标《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313—2018）。色谱柱为C18，用标准品制备标准曲线，各成分含量按标准曲线计算。

4.细胞培养和处理

BEL-7402 细胞采用体积分数为10%的胎牛血清的1640 培养液培养。当细胞生长成80%融合时，在培养基中加入质量体积分数为0.1%的白茶水提物处理细胞（参照前期研究结果），同时以不含白茶水提物的培养基培养的细胞为对照组。培养不同的时间后收集细胞用于后续检测。

5.DAPI染色法检测细胞核变化

BEL-7402 细胞接种于24 孔板中后，以含0.1%的白茶水提物的培养液培养8、16、24、48 h后，弃培养液，用PBS 洗涤1～2 遍，经4%多聚甲醛固定15 min后，DAPI染液染色15 min，再用甲醇漂洗1 次，滴加适量抗荧光淬灭剂后，荧光显微镜（Nikon ELIPSE Ts2R）观察结果并拍照。

6.TUNEL检测法

采用与前述相同的培养方法培养BEL-7402细胞8、16、24、48 h 后，弃培养液，按TUNEL 检测试剂盒说明书检测细胞内DNA断裂情况，具体操作如下： PBS 润洗1～2 遍；细胞固定液固定15 min；PBST润洗3遍；滴加适量的TUNEL检测液，室温避光孵育1 h；PBS 洗涤3 次；滴加适量抗淬灭剂，荧光显微镜（Nikon ELIPSE Ts2R）下观察结果并拍照。

7.Caspase-3活性检测

待BEL-7402细胞生长至80%融合时，以质量体积分数为0.1%的白茶水提物处理细胞8、16、24、36、48 h 后收集细胞，按照Caspase-3 活性检测试剂盒说明书检测Caspase-3的活性。具体操作如下：首先采用BCA蛋白定量检测试剂盒检测样品中的蛋白浓度；再用标准品制作标准曲线；将收集的细胞裂解后，离心取上清加入Ac-DEVD-pNA检测试剂，37℃反应2 h后，酶标仪(Thermo Variokan LUX)读取OD值；结合标准曲线和蛋白浓度检测结果计算样品中Caspase-3的活性。

8.Real-time PCR检测细胞内p53和p21的表达水平

采用Real-time PCR 检测细胞内与凋亡相关基因的表达情况。具体操作如下：首先用预冷的PBS 洗涤细胞3 遍，尽量去除残留的PBS 后加入TRIzoL裂解细胞并收集样品，按照试剂盒说明书提取总RNA，再用DNA 酶去除残留的基因组DNA，采用多功能酶标检测样品的OD260∶OD280，分析RNA 纯度后，取2 μg 的总RNA 用于反转录合成第一链cDNA（cDNA 第一链合成试剂盒为Fermentas 公司生产，具体操作按照试剂盒说明书）。然后各取1 μL cDNA 为模板，进行Realtime PCR定量分析细胞内p53和p21表达水平，所用引物序列如表1（根据GenBank所提供的各基因的CDNA序列设计），内参为GAPDH。

9.统计学方法

应用双因子方差分析（Two-way ANOVA）进行各试验组之间的差异分析，结合Dunnett-t 检验法分析比较各实验组与对照组之间的差异。

二、结果与分析

1.白茶和白茶水提物中咖啡碱和各儿茶素组分含量

按照国标法测定WTAE 的提取率为（42.1±4.8）mg/g（表2）。 采用液相色谱法测定WT 和WTAE 中咖啡碱和各儿茶素组分的含量，结果如表2 所示。WTAE 中各成分含量均高于WT。此外，本试验结果和已有的报道存在差异。

2.细胞核的形态学变化

BEL-7402 细胞经WTAE 处理8、16、24、48 h后，采用DAPI检测试剂盒检测细胞核的形态变化。结果如图1 所示，在WTAE 作用16 h 后，BEL-7402 细胞的细胞核浓染，细胞核开始浓缩；作用24 h 后，细胞核浓缩较明显，作用48 h 后，核进一步浓缩，显示典型凋亡细胞的核特征。由以上试验结果可知，WTAE能导致BEL-7402出现明显的细胞凋亡的形态学特征。

3.WTAE能诱导细胞内染色体DNA的降解

采用TUNEL 法检测白茶作用下BEL-7402 细胞内染色体DNA 是否发生降解。结果（图2）发现经WTAE处理16 h后，经TUNEL标记细胞核出现较弱的荧光信号；24 h荧光信号较为明显；48 h后信号更为明显，而各对照组的细胞未见任何标记信号。因此认为，WTAE能导致BEL-7402细胞的染色体DNA发生降解。

4.WTAE对细胞内Caspase-3活性的影响

BEL-7402 细胞用含WTAE 的培养液培养8、16、24、36、48 h 后，收集细胞采用分光光度法检测细胞内的Caspase-3 的活化水平。结果如图3所示，经WTAE 作用8 h 后，细胞内Caspase-3 的活性水平明显升高，且在24 h 活性最高；36 h 后活性下降，但也明显高于对照组。 Caspase-3 的活性变化符合凋亡细胞内Caspase-3 活性变化规律。

表1 引物序列

图1 DAPI染色法检测细胞核的形态变化（400×）

表2 白茶和白茶水提物成分分析mg/g

图2 TUNEL法检测染色体DNA断裂情况（400×）

5.WTAE对p53和p21表达水平的影响

采用Real-time PCR 检测WTAE 处理组和对照组细胞内p53和p21表达水平。从试验结果（图4）可以看出，在WTAE 作用下，BEL-7402 细胞内p53 和p21 的mRNA 水平明显升高，与对照组相比，差异显著，说明WTAE能使细胞内p53和p21表达水平显著升高。

图3 BEL-7402细胞内Caspase-3的活性变化

图4 Real-time PCR检测细胞内p53和p21的表达水平

三、讨论

福建闽东所产的白茶为非发酵茶类，其加工过程缺乏发酵、烘焙以及前期的萎凋等工序，这些工序会使茶叶中的儿茶素转化成茶黄素和其他复合多酚[11]。因此，白茶中有较高含量的EGCG等具有抗氧化作用的多酚类物质[12]，这些物质是茶类发挥保健作用的主要活性成分。由于不同的研究中所采用的白茶的茶叶种类、加工和提取条件等存在差异，因而不同的文献中所报道的白茶或其提取物中的有效成分含量存在差异。尽管本试验分析白茶水提物和白茶的有效成分结果和已有的文献报道存在差异，但也证明了白茶中有较高含量的儿茶素。前期研究[11]发现，WTAE 能明显抑制Hela细胞和BEL-7402细胞的增殖，而且WTAE所导致的死亡细胞结构完整，不能被台盼蓝着色。因此我们怀疑WTAE 所导致肿瘤细胞增殖抑制是通过诱导细胞凋亡实现的。在本试验中，DAPI染色试验结果发现，在白茶水提物的作用下，BEL-7402的细胞核出现明显的浓缩，并且TUNEL法检测亦显示在WTAE 作用下，BEL-7402 细胞内染色体DNA 出现断裂。此外，WTAE 还能使细胞内Caspase-3的活性显著升高，以上现象是细胞凋亡发生的典型特征，因此，诱导肿瘤细胞凋亡是白茶水提物实现对肿瘤细胞增殖抑制的主要方式。

p53 和p21 是与细胞凋亡有关的重要信号蛋白[13-14]。当细胞遭遇异常情况如DNA受损时，p53表达水平和活化水平会显著升高，一方面p53 可以阻断细胞分裂周期导致细胞增殖受阻，另一方面p53可以充当促凋亡蛋白因子（如p21）的转录因子，提高其表达水平，引导细胞进入凋亡程序[15-17]。定量PCR 结果发现WTAE 作用下，BEL-7402 细胞内p53 和p21 的表达水平均有升高，说明WTAE 所引起的肿瘤细胞凋亡与p21 和p53有关。但是WTAE是如何活化肿瘤细胞内与凋亡相关的信号通路来影响p53 等凋亡相关蛋白因子的表达水平的，有待进一步研究证明。

本项研究证明了WTAE 能通过诱导BEL-7402细胞凋亡而抑制其增殖，为白茶的抗肿瘤保健作用提供重要的理论依据，并为阐明WTAE 诱导肿瘤细胞凋亡机理奠定了基础。