基于高通量测序分析老面中菌群多样性及其对馒头品质的影响

高 静 刘 敏 吴丹丹 周中凯

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

老面作为传统发酵剂，发酵历史悠久，主要以野生酵母、乳酸菌等多种细菌为发酵菌种，再加入面粉和成面团，过夜发酵，次日在面团中添加面粉和适量碱，和面后成型醒发蒸制，即得老面馒头[1-2]。干酵母为纯种发酵，虽然发酵速度快，但存在风味单一、营养价值不高等缺点。而传统发酵剂老面经过多种微生物糖化和酯化的协同作用，可生成醇、烃、酯、醛、酮、酯、芳香物质等多种风味物质，使馒头营养价值更高[3]。同时，在老面发酵期间有些菌产生淀粉酶以及蛋白酶等酶类，对面团流变性有很好的改善作用，使馒头组织结构柔软细腻，富有韧性，老化速率减缓，货架期延长[4]。老面发酵使面团更有弹性，更加松软，从而改善馒头的比容和质构。因此，研究老面中的菌群多样性具有十分重要的意义。

基因可作为揭示生物物种的特征核酸序列，是最适于细菌系统发育和分类鉴定的指标。16S rDNA扩增子测序技术已成为研究环境样本中微生物群落组成结构的重要手段[5-7]。利用Hiseq平台对ITS1或ITS2区进行测序，具有测序深度高、利于鉴定低丰度群落物种以及费用低的特点，也成为研究真菌群落多样性的首选之策[8-9]。

本研究以4种不同地区的老面为主要研究对象，利用高通量测序技术，对老面菌群16sV4区(细菌)和ITS1区(真菌)进行扩增，HiSeq测序平台测定其基因序列，在与SILVA的SSUrRNA数据库(细菌)和Unit数据库(真菌)中的基因序列进行比对，即可得到老面中微生物种类及丰度；并分析比较纯酵母发酵和老面发酵对馒头比容和质构的影响。有利于了解传统发酵剂老面中复杂的菌群结构及微生物对面团及馒头品质的影响，同时为面食的工业化生产提供重要的数据参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦粉：金沙河家用小麦粉(中筋粉)；干酵母：安琪高活性干酵母(Y)；老面：来自河北邢台(HB)、山西运城(SX)、山东曹县(SD)、云南丽江(YN)。

汉尚HM740和面机；LHP-160恒温恒湿培养箱；BVM6630面包体积测定仪；TA.XT.Plus质构仪。

1.2 方法

1.2.1 测序过程

测序过程：老面样品准备→基因组DNA的提取和PCR扩增→PCR产物的混样和纯化→文库构建→Hiseq上机测序

1.2.2 生物学信息分析

PCR产物采用Illumina HiSeq高通量测序平台进行高通量测序。对高质量序列提取后进行生物学信息分析，包括：OTUs聚类分析、菌群多样性(Chao1、Shannon指数)分析、稀释性曲线分析、菌群群落种类和丰度分析；可全面了解老面中菌群结构组成。

1.2.3 老面馒头品质分析

老面馒头的制作工艺参数由前期的单因素和正交实验确定，干酵母馒头的制作根据说明书进行馒头蒸制。馒头的制作工艺流程：老面、小麦粉、水→和面→发酵→分割、整形→二次醒发→蒸制。

馒头冷却一定时间后，将其平整地放在体积仪样品测定区进行测定，并记录比容值；从冷却好的馒头中间部分切出表面平整的尺寸2 cm×2 cm×2 cm的样品，置于P/36 R探头下进行质构测定。每种样品至少测定3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 老面中微生物测序数据结果

数据处理过程中各步骤得到的统计结果见表1和表2。细菌测序获得的Tags序列有效率除HB样品为88.01%，其他样品都达到了92%以上；真菌测序获得的测序Tags序列有效率达97%以上，测序结果较为理想。

表1 高通量测序序列基本信息(细菌)

表2 高通量测序序列基本信息(真菌)

2.2 OTUs统计及多样性分析

对4种老面样品在97%一致性阈值下的菌群多样性进行统计，如表3。Chao1指数的大小可表示菌群丰度，值越大，菌群丰度越大；Shannon 指数的大小可表示菌群多样性，值越大，菌落多样性越高[10-11]。从表3可看出：4个老面样品经鉴定共获得667个细菌OTU和331个真菌OTU；HB样品的Chao1指数和Shannon指数最高，其次是YN，SD和SX相近且最低；说明HB样品中的物种复杂度最大，细菌菌群多样性最丰富，其次是YN样品，而SD和SX样品的物种丰富度和群落多样性均为最低。SX样品的Chao1指数和Shannon指数等都明显低于其他3个样品，说明SX样品的物种丰富度和群落多样性最低；SD和YN老面样品的真菌菌群丰度和菌群多样性较高。

表3 样品中OTUs和多样性比较

由图1a可看出，SX和SD样品的曲线几乎重合且趋于平缓，说明SX和SD样品的丰富度相近且测序数据量已接近合理，测序深度已基本覆盖样品中所有细菌，也间接说明这2个样品中的菌群复杂程度相对简单；而HB的稀释曲线最高，且HB和YN样品的稀释曲线高于其他2个样品(SX和SD)，说明HB和YN样品比SX和SD样品中的物种复杂度高。由图1b可看出，SX样品的曲线最低且最平缓，说明SX样品的真菌复杂度最低且测序数据量合理；而其他3个样品中SD样品的菌群复杂度最高，且显著高于SX样品，其稀释曲线结果与OTUs统计结果相吻合。

图1 稀释曲线

2.3 物种注释

根据物种注释结果，选取每个样本在门(Phylum)和属(Genus)水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱状堆积图。

由图2可知，这4种不同地区老面样品中优势真菌菌门主要是担子菌门(Basidiomycota)，在HB、SX、SD和YN样品中所占比例分别为99.32%、99.81%、98.94%和99.26%。而优势细菌菌门主要是厚壁菌门(Firmicutes)和生氧光细菌门(Oxyphotobacteria)。厚壁菌门在HB、SX、SD和YN样品中所占比例分别为52.466%、61.515%、53.931%和62.555%。生氧光细菌门在HB、SX、SD和YN样品中所占比例分别为41.004%、35.540%、42.877%和34.892%。另外，这4种老面样品中拟杆菌门(Bacteroidetes)存在显著差异；HB样品中拟杆菌门所占比例为3.740%，其他样品(SX、SD和YN)所占比例依次为0.053%、0.069%和0.145%。数据表明，4个老面样品的菌群结构在门水平存在差异。

图2 门水平上的物种相对丰度柱形图

由于样品性质和数据库的限制，真菌注释不到属水平，所以未列出真菌在属水平的相对丰度图。由图3可知，从细菌的属水平看，这4种老面样品中菌群组成存在差异；其中，YN样品与其他3个样品存在显著性差异。除了未确定的-生氧光细菌门(unidentified-oxyphotobacteria)，HB、SX和SD样品中以片球菌属(Pediococcus)为主，所占比例为43.166%、57.278%和50.320%，而YN样品仅为4.227%；YN样品中以乳杆菌属(Lactobacillus)为主，占比为53.573%，其他3种样品占比分别为5.376%、3.715%和3.232%；此外，还有一定量的明串珠菌和魏斯氏菌等。来自于北方的2个老面样品(SX和SD)菌群结构在属水平上较为相似，与来自于南方的老面样品(YN)存在显著差异，具有明显的地区特色。

图3 属水平上的物种相对丰度柱形图(细菌)

自然发酵面团中普遍含有的菌群主要是片球菌属或乳杆菌属，可能在面团发酵中发挥着重要的作用。张国华等[12]通过对老面的菌群结构研究发现，乳杆菌属在自然发酵面团中最普遍；片球菌常存在于植物性发酵食品中，在发酵面团中也常被发现。Vuyst等[13]发现酵头中乳酸菌包括魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、明串珠菌属(Leucouostoc)和乳球菌属(Lactobacillus)等。Corsetti等[14]发现传统酵头中最常见的乳酸菌类群是乳杆菌属，主要包括 Lb.sanfranciscensis、Lb.rossiae、Lb.paralimeutarius、植物乳杆菌(Lb.plautarum)和短小乳杆菌(Lb.brevis)等。乳杆菌属是馒头传统发酵剂中的优势菌群，对馒头质构具有一定的改善作用。郁书怀[15]研究表明片球菌属中的乳酸片球菌和戊糖片球菌能够发酵产生一种天然防腐剂PLA，具有广阔的发展前景。

2.4 物种丰度聚类热图

根据菌群OTUs聚类分析，选取出丰度较大菌属，从物种层面上进行聚类，绘制成热图，可看出哪些物种在样本中聚集较多或含量较低。结果如图4。

由图4可以看出，不同地区老面丰度较大细菌(属)和真菌(属)的种类差别较大，形成特定的菌群结构。HB老面样品中丰度较大的细菌菌群数量明显多于其他3个老面样品，说明HB样品细菌菌群丰富度较高；SD老面样品中丰度较大的真菌菌群数量略多于YN样品，明显多于其他2个老面样品，说明SD样品真菌菌群丰富度较高，且这4种老面在菌属分布上存在显著差异。

图4 各样品在属水平菌落相对丰度

在蒸制馒头的过程中发现，HB样品的发酵力明显优于其他3个样品，这可能与其含有的丰富的菌群有关。另外，HB样品中的链霉菌属(Streptomyces)微生物可产生丰富的次生代谢产物，且具有良好的生物活性[16]。考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)和栖粪杆菌属(Faecalibacterium)具有短链脂肪酸产生的功能[17]。而真菌菌属主要有毛壳属(Chaetomium)和散尾鬼笔属(Lysurus)。

SX样品中丰度较大的细菌菌属主要有片球菌属(Pediococcus)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)和醋杆菌属(Acetobacter)；真菌菌属主要有Lactifluus和Wickerhamomyces。SD样品中丰度较大的真菌菌属主要有Arthrocladium、Knufia、Graphium、葡萄穗霉属(Stachybotrys)等。

YN样品中含有丰富的乳球菌属、乳杆菌属等，张宜凤等[18]在云南的传统乳制品中就发现了丰富的肠球菌属、乳球菌属和乳杆菌属，是贡献风味的主要菌群。另外，YN样品中还含有丰富的真菌菌属，鉴定出曲霉属(Aspergillus)和根霉属(Rhizopus)。

2.5 PCA分析

基于OTU水平的PCA分析结果展示如图5。由图5可知，SX样品与SD样品距离最接近，说明这2种样品的细菌菌群组成最相似；SX样品和SD样品与其他2个样品距离较远，说明与其他2个样品细菌菌群组成差异较大。而真菌菌落PCA分析结果显示SX和HB样品的距离最近，与其他2个样品距离较远，说明SX和HB这2种样品的真菌菌群组成最相似，与其他2个样品的真菌菌群组成差异较大。综上，YN样品与其他3个样品的菌群组成差异最大。

图5 各样品菌群结构的PCA分析

表4 馒头的质构参数

注：表中数据为平均值±标准差； 同列不同小写字母表示4种老面馒头的质构参数在0.05水平存在显著差异(n≥3)。

2.6 馒头的品质分析

由图6可知，5种馒头的比容从大到小依次为HB>SD>YN>SX>Y，4种老面馒头的比容均大于干酵母馒头，且HB老面馒头比容最大，说明老面馒头比干酵母馒头柔软。老面在长时间发酵下形成了稳定的面筋网络结构，持气能力增强，比容增大。由表4可知，相对于干酵母馒头，老面馒头的质构特性均得到改善。其中，老面馒头和干酵母馒头的弹性无明显差异；而硬度、胶着度和咀嚼度显著低于干酵母馒头，黏聚性和回复性均高于干酵母馒头；原因是老面发酵充分，使馒头富有弹性，内部结构细腻柔软，使口感和质地优于干酵母馒头，这也是老面馒头的优势所在[19]。

图6 馒头的比容注：不同小写字母表示4种老面馒头的比容在0.05水平存在显著差异(n≥3)。

这4种老面馒头中，HB老面馒头品质最优，SX和SD老面馒头质构特性最相近，YN老面馒头质构特性稍低，但仍优于纯酵母馒头。其中，HB老面馒头的比容最大，质构硬度、胶着度和咀嚼度最低，弹性和回复性最大，这可能与HB样品中丰富的菌群结构有关。田晓会[20]发现，老面发酵面团的高径比显著大于酵母发酵，而且老面馒头的高径比略大于酵母馒头。SX样品中菌群多样性虽然较低，但其质构特性仍优于纯酵母发酵馒头，可能与其中的醋酸杆菌属有关。张月阳[21]研究发现，相对于安琪酵母发酵，另外添加醋酸菌可增加馒头比容，使馒头的硬度和咀嚼度显著降低，且营养价值高。SD样品的细菌菌群多样性较低，真菌菌群多样性较高，但SD老面馒头的质构特性也优于纯酵母馒头，可能与其丰富的真菌菌群有关，真菌菌群可分泌丰富的酶类物质，对馒头质构评价有所改善。方晓波等[22]发现在馒头中添加一定量的真菌α-淀粉酶可提高馒头的质构特性。杨春玲等[23]发现在馒头粉中添加适量的葡萄糖氧化酶和真菌淀粉酶可改善面团的流变性和馒头成品品质。

另外，对最大相对丰度前10的属进行物种分类树统计发现，HB、SX和SD样品中存在丰富的戊糖片球菌(Pediococcus-pentosaceus)，HB和YN样品中存在丰富的发酵乳杆菌(Lactobacillus-fermentum)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus-sanfranciscensis)和魏斯氏乳酸菌(Weissella-cibaria)等。它们都是发酵食品中常见的优势菌，而且发酵乳酸菌和魏斯氏乳酸菌都是益生菌。旧金山乳杆菌是传统酸面团中的优势乳酸菌，能很好地利用面粉中的主要糖类麦芽糖，对馒头的风味和质构有重要的影响。

馒头的比容主要是因为面团中的初始微生物的变化引起的。菌种变化不明显，产气量会减少，同质量的比容会变小，一定量的产酸酸化作用，可以促进酵母的生长代谢，增加酵母产气量，增大面制品的比容[24]。由此可见，老面中的混合菌发酵可增加馒头比容，改善馒头的质构特性。

3 结论

4个老面样品经鉴定共获得667个细菌OTUs和331个真菌OTUs，细菌多样性大于真菌多样性。老面中优势细菌菌门为厚壁菌门，真菌菌门为担子菌门。HB、SX和SD老面样品以片球菌属为主，YN 老面样品以乳杆菌属为主。不同地区老面样品丰度较大的细菌(属)和真菌(属)的种类差别较大，形成了特定的菌群结构。老面中丰富的菌群，可增加馒头比容，降低馒头硬度和咀嚼度，使馒头更加柔软，富有弹性。老面中还存在丰富的益生菌，可改善人的肠道健康，使馒头营养价值更高。本研究可为传统主食的产业化提供一定的参考；但本研究未对老面中的优势菌种进行纯化鉴定，还需要进一步探索。