MiR-183及let-7家族在肝癌患者血清中的表达

杨 光，王占宝，董 昕，于明钢

肝 细 胞 癌（hepatocellular carcinoma，HCC）近年来发病率及死亡率呈上升趋势[1]。目前多种新型检测方法正在逐渐兴起，其中对小分子非编码RNA（microRNAs，miRNA）的探索逐渐成熟。miRNA通过作用于靶基因的3'非编码区，控制目的基因表达的作用[2]。MiRNA-183家族是一组定位于7号染色体上三种微小RNA的总称，分别为 miRNA-183、miRNA-182及 miRNA-96，三种miRNA在结构上具有高度保守性。目前已知miRNA-183家族在多种癌症中表达异常。Let-7家族由定位于9种不同染色体上的13种成员组成，相关研究显示let-7在肝癌中的下降程度与临床病理特征之间也存在关系。本研究收集2013年11月—2015年5月于天津市第三中心医院治疗的肝癌患者58例，选取miRNA-183家族中miR-182及miR-96与let-7家族中的let-7a、7b、7c及7e作为研究对象，检测这6种miRNA在肝癌、肝良性疾病、正常人群血清中的表达水平，并进一步分析其与临床病理特征之间的关系，探究循环miRNA在肝癌诊断及预后方面的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 （1）肝癌组共58例，男38例，女20例；年龄50岁以上32例，低于50岁26例，合并乙肝49例，乙肝阴性9例。瘤体体积大于3 cm者45例，小于3 cm者13例。合并肝硬化51例，未患肝硬化7例。TNM分期I～II期30例，III～IV期28例。病理检查高-中分化44例，低分化14例。（2）肝硬化组30例，男18例，女12例，年龄50岁以上23例，低于50岁7例，合并有乙肝28例，乙肝阴性2例。（3）肝炎组共40例，男22例，女18例，年龄50岁以上26例，低于50岁14例。（4）健康对照组40例，男16例，女24例，年龄50岁以上22例，50岁以下18例。血清标本均术前治疗前抽取。

本研究取得所有受试者的知情同意并得到医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器 血清/血浆RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；TaqMan®microRNA转录试剂盒、U6及miR-183特异性逆转录引物购自美国Applied Biosystems公司；实时荧光定量PCR试剂、U6及miR-183的特异性探针均购自美国Applied Biosystems公司。荧光定量PCR仪ViiATM7购自美国Applied Biosustems公司，PCR扩增仪购自中国杭州大和热磁有限公司，分光光度计购自德国Eppendorf公司。

1.3 血清miR-183表达量的检测 （1）总RNA的提取。严格按照提取说明书进行总RNA的提取，用分光光度计检测提取RNA的浓度及纯度，A260/A280比值在1.8～2.2。将提取的总RNA保存于-80 ℃低温冰箱。（2）miR-183及内参U6的逆转录反应。按照逆转录试剂盒反转录合成cDNA，反应体系15μL包括2.0 μL总RNA、3.0 μL茎环逆转录引物（5×）、0.15 μL dNTP混合物、1.5 μL逆转录缓冲液（10×）、1.0 μL逆转录酶、0.19 μL RNA酶抑制剂、7.16 μL DEPC水；反应条件为 16 ℃， 30 min、42 ℃， 30 min、85 ℃，5 min。U6作为内参。（3）荧光定量PCR。按照试剂盒进行操作，反应体系共20μL包括10μL混合物、1μL引物（20×）、1.5 μL cDNA 模板、7.5 μL DEPC水。反应过程为 95 ℃ 10 min ； 95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，共 40 个循环。2-ΔΔCt法计算相对表达量ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组。每个样本独立重复实验2次。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，因检验指标呈非正态分布，用中位数和百分位数表示[M(P25，P75)]，组间比较采用秩和检验；分类资料采用χ2检验；受试者工作特征曲线用于确定筛查肿瘤患者的最佳界定值。双侧P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌与肝良性疾病中6种miRNA的表达水平

2.1.1 miR-182及miR-96的表达水平 肝癌血清中miR-182表达量为2.06，高于肝硬化血清的1.66、肝炎血清的1.18以及正常对照组的1.07（ 分 别 为Z=4.362，P＜0.01；Z=7.702，P＜0.01；Z=7.612，P＜0.01）；肝硬化组的血清miR-182水平大于肝炎组及正常对照组（Z=5.728，P＜0.01；Z=5.731，P＜0.01）；肝炎组与正常对照组的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。肝癌血清中miR-96为1.68高于肝硬化血清中的1.35、肝炎血清的1.18以及正常对照组的0.93（Z=3.759，P＜0.01；Z=6.227，P＜0.01；Z=6.846，P＜0.01）；肝硬化组的血清miR-96大于肝炎组及正常对照组（Z=2.730，P＜0.01；Z=4.635，P＜0.01）；肝 炎 组 的 血 清miR-96大 于 正 常 对 照 组（Z=3.393，P＜0.01）。见图1。

图1 四组血清标本miR-182及miR-96的相对表达量

2.1.2 let-7a、let-7b、let-7c及 let-7e在 四 组 标本中表达量 肝癌血清中let-7a的表达量为0.98，少于肝硬化血清中的1.20、肝炎血清中的1.22及正常对照组的1.19（Z=2.610，P＜0.01；Z=3.542，P＜0.01；Z=3.358，P＜0.01）；肝硬化、肝炎及正常对照组血清中的let-7a的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。肝癌血清中let-7b的表达量为1.10，肝硬化血清中为1.13、肝炎血清中为0.89，正常对照组的血清let-7b为0.93；肝炎组的表达量小于肝癌组及肝硬化组（Z=2.002，P=0.045；Z=1.976，P=0.048）；其他组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。正常对照组血清let-7c的表达量0.98，小于肝癌组的1.43、肝硬化组的1.29及肝炎血清中为1.20（分别为Z=4.840，P＜0.01；Z=2.968，P=0.003；Z=2.459，P=0.014）； 肝癌组的血清let-7c表达量大于肝炎组的表达量（Z=3.141，P=0.002）；其他各组间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。肝癌血清中let-7e的表达量为1.30，肝硬化血清中为1.13，肝炎血清中为1.26，正常对照组为1.17；肝癌组表达量大于肝硬化组（Z=2.078，P=0.038）；其他各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。let-7的表达情况见图2。六种miRNA与内参在384板上的分布实图见图3，miRNA生成图见图4。

2.2 肝癌组血清中 miR-182及miR-96与患者临床病理特征之间的联系 六种miRNA中miR-182及miR-96与肝癌部分临床病理特征间存在关系，而let-7家族在四组间的表达差异本身不显著且未见明显一致的趋势，不予分析。结果表明，miR-182在肝癌中的表达量与分化程度、是否伴有肝硬化以及肿瘤的TNM分期有关系，低分化肝癌大于高-中分化肝癌（Z=2.072，P=0.04），TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期的表达量大于Ⅰ～Ⅱ期（Z=2.125，P=0.03），伴有肝硬化患者的表达量大于不伴有肝硬化的患者（Z=2.208，P=0.03）；血清miR-182的表达量与年龄、性别、肿瘤大小、HBV是否阳性之间差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-96的表达趋势与miR-182相似，与分化程度及TNM分期有关系，其中低分化肝癌的血清表达量大于高-中分化肝癌（Z=2.017，P=0.04）, TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期的表达量大于Ⅰ～Ⅱ期（Z=2.101，P=0.04）；在年龄、性别、是否伴有肝硬化等方面差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图2 四组血清标本let-7家族的相对表达量

图3 六种miRNA及内参在384孔板上的分布实图

图4 mi-RNA的形成路径

2.3 血清中miR-182及miR-96对于肝癌的诊断价值

2.3.1 血清中miR-182对肝癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，miR-182可能用于肝癌患者的筛查,ROC的曲线下面积为0.901（95% CI=0.783，0.913)，选取最佳临界值（cut-off）为1.57，该处的敏感性为82.8%，特异性为80.0%；相应的阳性预测值为69.6%，阴性预测值为89.8%。见图5。

2.3.2 血清中miR-96对肝癌的诊断价值 ROC曲线结果显示，miR-96可能用于肝癌患者的筛查,其曲线下面积为0.850（95% CI=0.786，0.915)，选取的最佳临界值（cut-off）为1.49，该处的敏感性为70.7%,特异性为90.0%；对应的阳性预测值为77.4%，阴性预测值为85.3%。见图6。

表1 肝癌血清中miR-182及miR-96与临床病理特征间的关系

图5 血清miR-182用于诊断肝癌的ROC曲线

图6 血清miR-96用于诊断肝癌的ROC曲线

3 讨论

MiRNA来源于细胞核，相关基因首先转录形成初始miRNA，在剪切酶的作用下进一步生成具有茎环结构的pre-miRNA，后转运至细胞质中并在Dicer酶的作用下剪切成18～25个核苷酸大小的双链miRNA。miRNA与癌症的形成、发展及预后有密切关系， miRNA与肝炎后HCC的发生、进展关系密切，其不仅调控癌细胞凋亡及细胞周期也可调节癌基因与抑癌基因表达，作用具有双向性、网络型及特异性[3]。miR-183家族在肝癌组织中的研究尚较少，其中肝癌中呈高表达的miRNA-182可以下调MTSS1的表达，而MTSS1直接促进细胞转移。该研究也提示，miRNA-182及MTSS1可能作为肝癌的新型标志物[4]。肝癌中miRNA-183呈增高趋势，也可通过作用于PDCD4进而抑制TGF-beta1介导的细胞凋亡作用从而促进癌症发生[5]。而let-7家族在肝癌组织中的研究不少，一致的观点是在组织中呈低表达，起抑癌基因作用。Shimizu等[6]证实，bcl-xl是let-7的直接作用靶点，并由此调节肝细胞凋亡。Lan等[7]通过构建高表达let-7g的细胞系，发现其可下调c-Myc及上调p16INK4A，这也是let-7g在机体中抑制肝癌细胞扩增的靶点。本次研究主要探索miR-182、miR-96、let-7a、let-7b、let-7c及let-7e在肝癌血清中的表达趋势，进一步评估其作为肝癌新型生物标志物的能力。

本研究表明，肝癌血清中的多种miRNA与其在组织中的表达之间存在明显相关性[8]。我们既往研究证实，miR-183家族在肝癌组织中表达量增高，且与部分临床病理特征之间有联系。考虑到组织miRNA的提取困难，对肝癌诊断的可操作性低，本次选取血清作为研究对象。结果表明，miR-182及miR-96的表达量在肝硬化及肝癌中均上升，且肝癌中的表达量与TNM分期、分化程度等有关。

Xie等[9]发现，Let-7启动子区域的rs10877887位点与中国肝癌病人的生存期相关，可以作为预后指标。我们也曾对肝癌组织中四种let-7表达量进行检测，发现let-7a其表达量在肝癌组织中降低，这与其他文献报道的的结果相似，提示肝癌的发生可能通过某种机制下调了let-7a的表达[10]。相关研究表明let-7a是一种具有普遍性作用的抑癌基因，Meng等[11]研究发现通过基因芯片技术分析显示相较于正常肺组织，肺癌组织中let-7a的表达明显减低，与预后成正比。其在肝癌中的研究并不多，本研究提示了let-7a在肝癌中低表达可能参与了该细胞的恶性转化及不同临床分期的生物学指标。本次研究并未发现肝癌血清中let-7b、c、e变化的规律性，可能与样本数量不足或操作过程中存在较大误差有关，该结果有待进一步验证。

miRNA越来越多的功能正被人们验证，其不仅具有诊断肿瘤的潜力，也可判断肿瘤的分化程度、有无迁移、对药物的敏感性及肿瘤复发的检测。肝癌血清中miRNA的检测为早期诊断提供了新思路。对miR-183家族的探索表明其可能用作新型肝癌的生物标志物，或联合其他肿瘤标志物提高肝癌检出率。另一方面，let-7a在肝癌血清中表达下调，提示其可能对肝癌有一定的诊断价值，需要进一步实验来验证。