基于ISSR标记的大花三色堇遗传多样性分析

段 磊，王 霞，王梦圆，宋亚男

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132101）

大花三色堇（Viola × wittrockiana.Gams.）又名猫脸花、蝴蝶花，其品种丰富、花色艳丽、抗冻性强等优点，深受人们喜欢，并被誉为“花坛皇后”。大花三色堇在欧洲、美国和日本非常盛行，这些国家自19世纪便开始了大花三色堇的品种选育工作，现已取得了显著的成效，培育出了多种新奇的优良品种[1]。而我国针对大花三色堇品种选育方面的研究尚处于起步阶段，栽种的多为进口F1代种子，这些种子不仅成本高，而且对我国生境的适应能力差，因此，随着市场需求量的增加，选育适应中国生境、植株健壮、抗性强、具有中国知识产权的优良品种已是当务之急。

种质资源遗传多样性研究是进行新品种选育的重要内容。目前，我国针对大花三色堇遗传多样性方面的研究较少，仅有2例DNA分子标记方面研究的报道[1，2]，尚无利用简单序列重复区间扩增（inter-simple sequence repeat，简称ISSR）技术研究大花三色堇种质资源分类方面的报道。本试验利用ISSR技术分析24份大花三色堇材料的遗传多样性分析，为大花三色堇优良种质资源的收集、分类和良种繁育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

24份供试材料分别购自甘肃酒泉金秋园艺种业有限公司、美国泛美种子公司、英国弗伦诺瓦公司和北京花仙子农业有限公司（见表1）。

将种子消毒后接种于不添加任何激素的MS培养基中进行无菌培养，至三叶期取其叶片，于-20℃冷冻保存，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

参照王健[2]的方法，采用改良的SDS法提取大花三色堇叶片基因组DNA，然后分别利用核酸分析仪和1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的纯度和浓度，稀释DNA浓度至50 ng/µl，-20 ℃贮存备用。

1.2.2 试剂

taq DNA聚合酶、dNTPs、SDS等药品均购自北京全式金生物技术有限公司，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

注：a：甘肃酒泉金秋园艺种业有限公司；b：美国泛美种子公司；c：英国弗伦诺瓦公司；d：北京花儿朵朵花仙子农业有限公司。

1.2.3 ISSR-PCR扩增

在前期试验的基础上，选用10条扩增条带清晰、稳定、多态性强的引物扩增24份材料的基因组DNA，20µl的ISSRPCR反应体系，包括Mg2+2.5 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.2U、dNTPs 0.2 mmol·L-1、引物0.4 umol·L-1、DNA模板50ng。扩增程序为：94 ℃预热5 min；94 ℃变性40s，51℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，39个循环；72 ℃再延伸10 min；4℃保温。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

1.2.4 数据处理及分析

统计扩增条带，有带记为1，无带记为0，建立0、1矩阵图，利用NTSY-pc2.1软件计算不同样品间的遗传相似系数，并作聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA质量检测

24份材料基因组DNA的电泳条带清晰、明亮、无拖尾现象，核酸分析仪检测显示OD260/OD280值均在1.8-1.9范围内，DNA质量浓度在155-295 ug/mL范围内，所提基因组DNA纯度较高，可用作ISSR分析。

2.2 ISSR-PCR扩增结果多态性分析

10条引物扩增24份材料样品基因组DNA，扩增总片段数为91，其中多态性条带数为79，多态性比率为86.81%。

2.3 聚类分析

将24份材料基因组DNA 的扩增条带转化为0、1二元矩阵图，计算遗传相似系数，并在此基础上构建 UPGMA 聚类图，结果如图1所示，可知在遗传相似系数0.44处，24份材料可以分为2大类群，分别是美国泛美的XXL-YB和英国弗伦诺瓦的PAN575R聚为I类，其余为第II类，遗传相似系数为0.47时，第II类又可以分为2个亚类，其中酒泉金秋园艺公司的229.04与美国泛美种子公司的M-YC为A亚类，酒泉金秋园艺公司的其余品种与花仙子农业公司的2个品种为B亚类，且B亚类中颜色相近者、同一系列品种多聚在一起，可见，材料地理来源、颜色以及品系是影响大花三色堇遗传多样性的重要因素。

图1 24份大花三色堇的ISSR聚类图

3 讨论

ISSR技术是显性标记，它结合了RAPD的优点，同时克服了RAPD、SSR、RFLP等技术的缺点，不需要预先知道靶标DNA序列，具有高效、快速、稳定、易操作、成本低等优点，现已广泛用于指纹图谱构建、亲缘关系鉴定、遗传多样性分析等领域[3]。本研究通过分析24份大花三色堇材料的遗传多样性，发现国内材料遗传距离较近，结果同RAPD标记[2]和基于主成分的聚类分析[4]结果一致，说明现有国内栽培品种来源相近，种质交流受地域限制，这可能是由于大花三色堇的优良品种多为欧美、德国和日本等国研发，这些国家为了保护自身利益，限制了国际间的流通品种而造成的。为满足我国大花三色堇的市场需求，必须加快大花三色堇新品种选育的步伐。研究中还发现，花色与品系是影响大花三色堇遗传距离的重要因素，尤以花色最为明显，故可以推测不同花色的遗传基础是不同的。