稻花香2号SSR反应体系优化及引物筛选

潘天旭，张宇鹏，赵家慧，杨祥波

（吉林农业科技学院，生物与制药工程学院，吉林吉林 132101）

众所周知“泰国香米出福水，中国香米出五常”，而五常大米中最负盛名，最受人们欢迎的品种便是“稻花香2号”，因为黑龙江省五常市得天独厚的地理位置，使之在水质好、昼夜温差大、积温高的良好生态环境中得以产出，稻米采夏日骄阳之精华，集寒带黑土之肥沃，口味口感、营养价值远高于其他稻米品种[1]，“稻花香2号”与南方两熟甚至三熟的水稻相比，每年仅能产出一次稻谷，并且稻米产量也仅有其他水稻品种的三分之一，因其高品质稀有等特点使之在高端市场不仅颇受人们青睐，而且价格较普通稻米高出数倍，正因如此成为一些不法商家谋取不法利益的对象，市面上掺假“稻花香2号”种子现象不断出现，农户挑选种子时稍有不慎，就会损失惨重，农户家倾注一年的心血也将付诸东流，也使国家在知识产权保护和品种管理上面对面临巨大的挑战，因此研究出一种准确高效的品种鉴定技术，进行对水稻产业的掺假和售假现象加以监督和管理迫在眉睫[2]。

传统的品种鉴定根据稻谷的形态学性状和特点进行鉴定区分，但此方法鉴定周期长，误差较大，更容易受环境因素的影响，真实性较低，不能满足种子管理部门高效准确的新要求。而DNA分子标记技术应运而生便可以克服传统形态鉴定的缺点[3-4]，其中SSR（simple sequence repeats）技术是近几年来发展起来的建立在PCR基础上的 第二代DNA 分子标记技术，因为此鉴定方法用友快速，稳定，操作简单，成本低的优点，在水稻种子真伪检测起到了不可替代的作用[5-6]。由此技术建立的“稻花香2号”SSR-PCR反应体系在品种鉴别上提供经济，省时，准确的研究基础，在保护此品种的知识产权和育种研究者的权益意义重大。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料选取为 “稻花香2号”和其亲本“五优稻1号”均由 黑龙江省五常水稻所提供，在恒温30℃光照培养箱培育5d获得。

1.1.1 引物

选取农业部行业标准（NY/T 1433-2014）中的48对引物中筛《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记》（2014 年 6 月 1日实施）中 8对 SSR引物[7]。

表1 8个水稻 SSR标记引物的基本信息

1.1.2 实验试剂

（1）plant DNA so 植物基因组快速提取试剂盒（品牌：vastar）；

（2）nastar PCR mix（品牌：vastar）；

以上试剂均选自于长春市华程生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

选取幼苗期水稻叶片100g，用剪刀剪碎放入研钵中，用液氮充分研磨成粉末快速移入2ml移液管中后，用plant DNA so植物基因组快速提取试剂盒提取水稻全基因组DNA，详细方法见此试剂盒说明书，提取后的DNA再用紫外分光光度计检测质量浓度，加入适量0.1×TE溶液稀释成一定浓度并在-20℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR反应体系优化设计

10µL的反应体系，用模板 DNA 浓度、引物浓度、2×PCR mix 用量（由Taq DNA Polymerase mg2+，dNTPs 以及PCR稳定剂和增强剂的混和体系）作为影响因素，以 L16（43）正交试验设计优化方案（表2），共 16个处理方案，重复三次。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火30s；共35个循环；72℃延伸7min。扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的有无，清晰度及亮度筛选出最优的反应体系。

表2 SSR反应体系的正交试验设计

1.2.3 电泳检测

先用4%的琼脂糖凝胶电泳检测8对SSR引物扩增产物多态性，筛选出其中多态性高的扩增产物，再用6% SDS变性聚丙烯凝胶电泳分离。电泳结束后，首先进行冰醋酸（10%）固定20min，硝酸银溶液（2%）染色30min，ddH2O迅速漂洗5～10s，用显色液（3%无水碳酸纳溶液）显色10～15min，ddH2O漂洗1～5min，室温环境中自然晾干，拍照，观察并记载带型，统计结果数据。

1.2.4 结果判定

根据农业部稻米及制品质量监督检验测试中心制定标准[7]得知：两个品种进行变性聚丙烯凝胶电泳后的条带存在两个或两个以上的位点差异时，表明为不同的品种，当仅有一个位点存在差异时，表明为相似品种，若所有位点均相同，则为同一品种。

2 结果与分析

2.1 DNA提取的质量

品种真伪的鉴定准确性受DNA的质量影响较大，用紫外分光光度计检测OD260 /OD280 值应该在1.8～2.0之间，说明DNA质量高，纯度高，若OD260 /OD280值小于1.8或大于2.0，说明DNA 质量不佳，可能其中含有RNA或蛋白质。表2 的 DNA 提取结果显示，提取的 DNA 质量较高，完全符合PCR扩增的要求。

表3 DNA质量检测结果

2.2 PCR反应体系优化结果分析

如图1所示，泳道1～4在2×PCR mix 的浓度比较低反应体系中扩增出的条带十分模糊，其余12条泳道均有明显的条带，并整体上随着 2×PCR mix 的用量的增加条带亮度呈现先上升后下降的趋势，并在6µl时最为清晰稳定，说明此试剂最适用量为6µl。在由9～12泳道可明显发现随着引物浓度的增加条带亮度增加，逐渐清晰，说明引物在设计浓度范围内，较高浓度的引物有利于PCR反应扩增，模板DNA的用量在15～35之间均能产生较为清晰的条带，在此范围内对结果影响不大，从经济节约的角度考虑，以及高浓度的引物会导致引物二聚体的现象增加，影响试验结果，最终确定反应体系；引物0.8µmol·L-1，模板8ng，2×PCR mix 6µl。并且由此反应体系扩增的第11泳道的条带亮度最好，最清晰。

图1 PCR正交试验扩增产物电泳结果

2.3 SSR 引物的筛选

为了试验的准确性，本研究共利用8对引物在“稻花香2号”及其亲本“五优稻1号”进行初筛和重复性验证，均能扩增到清晰条带，但部分在亲本间没有明显差异，无多态性。最后确定引物RM366和引物RM297在亲本和杂种F1中存在扩增的谱带 单一清晰，存在多态性（图3），适合用于此品种的真实性检测。

图2 8对引物对“稻花香2号”及“五优稻1号”多态性筛选结果

3 结论与讨论

该研究从NY/T 1433-2014《水稻品种鉴定技术规程：SSR标记法》推荐适合东北粳稻的8对引物中筛选出2对可快速准确鉴定出“稻花香2号”的真实性，并且在试验中采用10 µl的反应体系，使引物和其他药品的用量大大减少，降低了检测费用；摸索出一套与品种和引物相适应的PCR反应条件，保证实验室检测结果的稳定性、重演性、准确性，真正为农业主管部门、执法部门提供最快速、最有利科学的鉴定技术。

为水稻品种真实性鉴定室内分子检测方法提供了判定依据，也能为农业行政执法部门开展执法工作以及种子市场监管工作提供相应的技术支撑，减少假劣种子进入市场的概率，促进黑龙江种业健康、有序、可持续发展。