液相色谱-串联质谱法测定牛奶中金刚烷胺残留的方法

张 佳，张慧利，柴 磊，关婷婷，成林林，秦 娜

（焦作市畜产品质量安全监测中心，河南焦作 450000）

1 前言

金刚烷胺是一类用于预防和治疗病毒感染的三环胺类抗病毒药物，主要用于鸡、猪流感的预防和早期治疗以及猪传染性胃肠炎的防治。农业部规定除经批准生产、使用的疫苗产品外，禁止使用金刚烷胺防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。目前主要有气相色谱法、毛细管气相色谱法、高效液相色谱-荧光检测法、毛细管电泳法及液质联用法等，普遍存在着前处理过程繁琐、检测灵敏度低和专属性差等缺点。本方法根据金刚烷胺的分子结构、化学性质，以现有文献为基础采用高效液相色谱-串联质谱法进行金刚烷胺残留的测定。经试验，该方法检测灵敏度高、专属性强、适用于牛奶中金刚烷胺残留的检测。

2 实验方法及步骤

2.1 原理

试样用1%甲酸乙腈提取，浓缩后用20%乙腈溶解，经正己烷去除脂肪，高速离心去除蛋白质等杂质后过滤膜，用液相色谱-串联质谱法测定，同位素内标法定量。

2.2 仪器设备与材料

液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）Waters UPLC TQ-S.；分析天平（精度0.00001g）；电子天平（0.01g）；高速冷冻离心机；多管涡旋振荡器；氮吹仪；移液器（5mL，1mL，200µl，50µl）；聚四氟乙烯离心管（50ml）；一次性注射器（1ml）；一次性针头过滤器（有机系，0.22µm）

2.3 试剂与溶液

甲酸（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；正己烷（色谱纯）；无水硫酸钠；（盐酸）金刚烷胺、盐酸金刚烷胺-D15对照品，纯度≥99%；1%甲酸乙腈溶液：量取1ml甲酸，加乙腈至100ml，摇匀即得；20%乙腈溶液，量取乙腈20ml，加水至100ml，摇匀即得；20%乙腈溶液饱和的正己烷：取20%乙腈溶液适量，与正己烷混合，摇匀后静置使分层。

2.4 实验步骤

2.4.1 样品添加：取空白试样2g，添加100ng/ml的混合标准中间工作液100µl，制得浓度为5µg/kg的阳性添加试样，与待测试样同步处理。

2.4.2 提取：称取已混匀的牛奶试样2±0.02g，置于50mL离心管中，加内标中间工作液（4.13）100µl，再加无水硫酸钠3g，1%甲酸乙腈溶液10ml，涡旋混匀，涡旋振荡20min。10000r/min离心10min，取上清液于50℃下氮气吹干。

2.4.3 净化：加入20%乙腈溶液1.0ml，充分涡旋溶解，再加入20%乙腈溶液饱和的正己烷2 ml，充分涡旋混合，8000r/min离心5min。吸取下层溶液至1.5ml离心管中，20000r/min离心5min，取下层清液过0.22µm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2.4.4 系列标准工作液的制备：准确量取适量的混合标准中间工作液，用20%乙腈溶液稀释成浓度分别为1、2、5、10、20、50ng/mL的系列标准工作液。

2.4.5 仪器参数与测定：色谱柱：Waters Acquity、UPLCTMBEH C18（1.7µm，2.1×100mm）；柱温：30℃；流动相：A：乙腈；B：0.1%甲酸溶液；进样量：2µL；电喷雾ESI；正离子扫描；多反应监测MRM；定性、定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量见表1。

表1 金刚烷胺及内标定性、定量离子对及对应锥孔电压和碰撞能量

3 结果与分析

采用单点校正，按下式计算：

校正因子按下式计算

供试样品中金刚烷胺残留量按下式计算

4 结论

本方法在2～5 0µg/k g添加浓度的回收率为70%～120%，检测限为1µg/kg，定量限为2µg/kg，在批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。本方法具有很高的灵敏度与准确度，适用于牛奶中金刚烷胺残留的检测分析。