结直肠癌中肿瘤相关巨噬细胞及基因表型的分析研究

武艳飞 白雪峰 王智

[摘要] 目的 结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）CD68+及CD163+的检测及与基因表型的关系。 方法 免疫组化方法检测41例CRC肿物，癌旁5 cm（M5）、10 cm（M10）。不典型增生（Atypical hyperplasia，AH）组织CD68+及CD163+的表达，采用病理切片扫描仪细胞计数。对41例CRC肿物进行基因检测。 结果 CRC患者CD68+及CD163+检测肿物组织高于癌旁5 cm、10 cm（P<0.01）;肿物与不典型组织比较差异无统计学意义（P>0.05）;癌旁组织M5与M10比较差异无统计学意义（P>0.05）;回归分析提示CD163+表达与K-ras基因突变有显著性关系（P<0.05）。 CD68+及CD163+的表达与B-raf基因突变、MSS（微卫星稳定型）、淋巴结转移、脉管癌栓、神经侵犯无相关性（P>0.05）。 结论 CD68+及CD163+在结直肠癌肿物间质中高表达，并高于癌旁组织，与AH表达无相关性。CD163+在肿物的表达与K-ras基因突变有相关性。

[关键词] 结直肠癌;CD68+;CD163+;基因检测;病理切片扫描仪

[中图分类号] R730.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）17-0036-05

[Abstract] Objective To detect the expression of CD68+ and CD163+ in tumor-associated macrophages（TAMs） in colorectal cancer（CRC） and its relationship with gene phenotype. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD68+ and CD163+ in 41 cases of CRC， paracancer 5 cm（M5）， 10 cm（M10）， and atypical hyperplasia（AH） tissues. Cell counts were performed using a pathological slice scanner. Gene detection was performed on 41 CRC tumors. Results The expression of CD68+ and CD163+ in CRC patients was higher than that of paracancer 5 cm and 10 cm tissues（P<0.01）. There was no significant difference between tumor and atypical tissue（P>0.05）. The difference was not statistically significant between paracancer M5 and M10 tissues（P>0.05）. Regression analysis indicated that CD163+ expression was significantly associated with K-ras gene mutation（P<0.05）. The expression of CD68+ and CD163+ was not associated with B-raf gene mutation， MSS（microsatellite stable）， lymph node metastasis， vascular tumor thrombus， and neurological invasion（P>0.05）. Conclusion CD68+ and CD163+ are highly expressed in the interstitial of colorectal cancer， and higher than the adjacent tissues， and have no correlation with AH expression. The expression of CD163+ in the tumor is correlated with the K-ras gene mutation.

[Key words] Colorectal cancer; CD68+; CD163+; Gene detection; Pathological slice scanner

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是发展中国家癌症死亡的主要原因之一。发达国家每年有1，300，000个新病例被诊断出来，而CRC则是其中之一。目前，外科手术切除是CRC唯一可能的治疗方法。在临床中，约有20%～25%的新诊断CRC患者出现远处转移，而且仅有很少一部分可以接受治疗性手术，此外，大约50%的CRC患者在切除肿瘤2年内会复发。研究表明，癌症不仅是由肿瘤细胞固有的激活关系来定义的，而且还由肿瘤相关微环境（The tumor microenvironment，TME）[1]招募和激活的免疫细胞来定义。迄今为止，免疫细胞在与肿瘤相关的微环境中的作用研究较少。与目前用于结直腸癌分期的组织病理学方法相比，免疫细胞在肿瘤样本中的位置更能预测患者的病情进展[2，3]。本研究通过对肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage，TAMs）标记物[4]CD68+、CD163+的表达水平[5]浸润肿瘤组织与癌旁组织、不典型增生的比较性研究，分析与基因突变、淋巴结转移及脉管神经侵犯的的关系，为临床治疗及预后监测提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月～2018年9月包头市肿瘤医院肿瘤切除的41例CRC患者的病历进行回顾性分析。所有的患者均未行手术治疗前的新辅助化疗或放疗。取肿瘤组织及癌旁5 cm及10 cm标本，41例结直肠癌患者中男26例，女15例。年龄37～86（63.76±10.01）岁，中位年龄64岁。其中结肠癌11例，直肠癌30例。有肠系膜淋巴结转移的19例，未见肠系膜淋巴结转移的22例。可见脉管侵犯的8例，未见脉管侵犯的33例。可见神经侵犯的10例，未见神经侵犯的31例。基因检测MSS（微卫星稳定型）30例，MSI-L（微卫星低度不稳定型）6例，MSI-H（微卫星高度不稳定型）5例;B-raf有1例存在基因V600E突变，其余表达均为阴性;K-ras表达19例出现基因突变[6]，22例为野生型。病理分型黏液腺癌4例，中分化腺癌24例，低分化腺癌13例。这些CRC患者的标本固定石蜡包埋。组织标本从病理档案中检索。患者信息通过电子设备获取医疗记录。包括年龄、性别、是否发生脉管癌栓及神经侵犯、肿瘤位置和肿瘤的描述。

1.2 主要仪器与试剂

CD68（克隆号kp1，批号180815041d）CD163（克隆号10D6，批号180613206b）鼠单克隆抗体，免疫组化S-P法检测试剂盒，DAB染色试剂盒，购自福建迈新生物工程有限公司。DAKO免疫组化仪（Autostainer Link 48）;LUMATAS免疫组化仪（Titan）;VENTANA免疫组化仪（Benchmark XT）。病理切片扫描仪，购自日本滨松光子学株式会社。基因检测试剂盒，购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。PCR荧光定量检测仪。

1.3 免疫组化流程及细胞判读标准

1.3.1 免疫组化流程  取结直肠癌患者的肿瘤组织，距肿瘤5 cm、10 cm处、不典型增生组织，每个标本进行3 μm切片，裱片在防脱载玻片上，二甲苯脱蜡无水乙醇脱二甲苯。经二甲苯脱蜡切片，水化后，进行抗原修复，室温孵育;孵育后用PBS洗涤，滴加一抗CD68+及CD163+ 37℃孵育1 h，用PBS洗涤后滴加二抗37℃孵育20 min，PBS洗净后滴加新配置的DAB试剂;再经复染、分化、返蓝、脱水、透明、封片、读片观察结果。

1.3.2 细胞判读标准  采用病理切片扫描仪扫描切片，低倍镜下对切片进行扫描，确定肿瘤密度TAMs最高的区域即热点区，在30倍视野下进行细胞计数。数10个视野取平均值，阳性细胞染色标准：细胞结构清晰，细胞浆、细胞膜染色明显，着色和背景对比清晰。

1.4 基因检测

1.4.1 DNA提取  石蜡切片，厚度8 μm，5～6张。将切片装于1.5 mL无菌离心管中，脱蜡，脱二甲苯。加入200 μL 缓冲液GA（Buffer GA）和20 μL Proteinase K进行孵育。再加入250 μL无水乙醇后离心，加入吸附柱CR2中，依次加220 μL缓冲液GB（Buffer GB）离心、500 μL缓冲液GD（Buffer GD）离心、2次600 μL漂洗液PW（Buffer PW）离心。放置5 min吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜滴加30～100 μL缓冲液TE，室温放置5 min，离心，将收集有DNA的离心管-20℃保存。

1.4.2 PCR扩增  分别加12.5 μL（B-raf、K-ras及MSI）反应液、6.5 μL 引物和4 μL水，加入已提取的DNA样本，离心后进行PCR扩增反应及一代基因测序。进行实验结果分析。

1.5 统计学分析

应用SPSS 22.0统计软件，将病理切片扫描仪的数据进行统计学分析，其中CD163+的表达情况不符合正态分布，肿物与癌旁5 cm、癌旁10 cm、不典型增生组织CD68+、CD163+ TAM的表达情况及差异用非参数Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用Bonferroni法，检验标准（α）为0.05。肿瘤组织中两种标记物表达量与病理参数的比较采用二元Logistic回归分析，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC中CD68+、CD163+巨噬细胞的表达与癌旁组织的比较

CD68+、CD163+在肿瘤组织表达不均[6]，主要在肿瘤的间质，多见于肿瘤坏死区的周围[7]。而癌旁组织及不典型增生组织表达多见于黏膜层。两者在肿瘤组织的表达水平均明显高于癌旁5 cm、10 cm（P<0.01），肿瘤组织与不典型增生组织比较，无统计学差异（P>0.05），癌旁5 cm与癌旁10 cm比较表达水平无统计学差异（P>0.05），提示结直肠癌组织中存在肿瘤相关巨噬细胞浸润。因此在不典型组织中CD68+、CD163+的表达与肿瘤组织无统计学差异，癌旁5 cm与癌旁10 cm的表达无统计学差异（表1、封三图4）。

2.2 CRC中CD68+、CD163+巨噬细胞的表达与病理参数关系进行回归分析

基因检测MSS（微卫星稳定型）30例，MSI-L（微卫星低度不稳定型）6例，MSI-H（微卫星高度不稳定型）5例将MSI不稳定型的归为一组;B-raf基因一例出现V600E突变，其余均为野生型;K-ras表达18例出现体细胞突变，突变形式B（Gly12Asp）5例、F（Gly 12Val）5例、D（Gly12Cys）4例、E（Gly12Ser）2例、G（Gly 13Asp）2例，将有突变的归为一组，与未出现突变的一组进行比较;采用二元Logistic回归分析，结果表明，CD163+巨噬细胞的表達与K-ras基因突变有相关性（P<0.05）。CD68+、CD163+巨噬细胞的表达与MSS、B-raf基因突变、淋巴结（Lymphonodus，L）转移及脉管癌栓（Vessel carcinoma embolus，VC）及神经（Nerve，N）侵犯无相关性（P>0.05），CD68+巨噬细胞的表达与K-ras基因突变无相关（P>0.05）。见表2、图1、2。

3 讨论

在过去的研究中，癌症细胞的基因组和生物学变化被广泛地研究，以确定不同预后和治疗反应的患者亚群，以及寻找潜在的药物靶点。现在人们认识到，TME对肿瘤细胞具有重要的支持作用。免疫细胞是肿瘤的主要组成部分微环境，通过与肿瘤的相互作用影响肿瘤进展和转移细胞。巨噬细胞通常是肿瘤微环境免疫细胞中最丰富的组成部分。巨噬细胞被认为具有表型和功能性可塑性，可以根据细胞的位置和肿瘤微环境中的细胞因子环境[8]，将其极化成M1或M2 巨噬细胞状态[9]。一般来说M1巨噬细胞，也被称为经典激活巨噬细胞，M2巨噬细胞是参与免疫调节、抗炎和支持肿瘤的活动。CD68在正常细胞和肿瘤细胞中广泛表达，使该蛋白不特异于单核细胞/巨噬细胞家族，是人类单核细胞和巨噬细胞的广泛标记;CD163（Cluster of Differentiation 163）清道夫受体为富含半胱氨酸的膜蛋白[10]，位于吞噬细胞表面，CD163是一种血红蛋白/结合珠蛋白复合物清除受体，位于吞噬细胞表面，只在循环单核细胞和组织巨噬细胞上表达，被认为是M2巨噬细胞的重要特异性标志物。M2巨噬细胞产生的许多因子促进肿瘤恶化，刺激肿瘤的生长[11，12]。

CD68+和CD163+标记[13]对巨噬细胞的定义可能有些不够全面，因为巨噬细胞是高度可塑性的细胞，可以显示一系列表型。然而，标记巨噬细胞仍可用于识别不同巨噬细胞群体的主要表型或功能。虽然我们用CD68+和CD163+标记检测巨噬细胞表达的，但仍有可能不是所有的巨噬细胞都表达这些标记物，因此在本研究中可能会失去部分巨噬细胞。还需要进一步的研究来验证，并寻找更特异的标志物。因此，通过检测基因MSS，B-raf及K-ras探讨与巨噬细胞的浸润的相关性[14]，寻找更多的方法研究肿瘤的性质和特点。

本实验通过免疫组化S-P法检测肿瘤部位、癌旁组织及不典型增生组织的表达情况，采用病理切片扫描仪进行细胞计数，30倍背景下10个视野取平均值，尽量减少误差。由于小样本病例研究，CD163+的表达不符合正态分布。因此采用非参数检验提示肿瘤组织中存在CD68+、CD163+巨噬细胞的浸润，且高表达于癌旁组织。

本次研究结果表明CD163+的表达水平与K-ras基因突变存在相关性。在CRC中通常有40%患者检测到K-ras突变。K-ras蛋白是EGFR信号传导通路中关键的下游调节因子，巨噬细胞的EGFR信号通路是结肠炎相关癌变（colitis-associated carcinogenesis，CAC）的关键组成部分[15]。一项生物体内侵袭实验表明TAMs通过肿瘤细胞和TAMs之间的旁分泌信号途径促进细胞运动和侵袭，巨噬细胞在这个途径中表达EGF，促进细胞形成细长的突起并被癌细胞侵袭[16]。

研究发现K-ras突变除了促进细胞内在的增殖和血管生成作用外，还可驱动具有M2 TAM极化的免疫抑制性肿瘤微环境[17，18]，募集骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），并增加Treg/Th17反应，这可能是由IL-6自分泌和旁分泌方式共同作用的结果。IL-6阻断不仅对肿瘤（上皮）细胞具有直接抑制作用，而且还可以使亲肿瘤免疫抑制环境向抗肿瘤表型转化[19]。因此巨噬细胞M2可能参与或影响了K-ras的突变路径，CD163+的表达水平增高，是否提示K-ras的突變率增加。

综上所述，巨噬细胞在TME中产生重要作用，影响肿瘤的发生发展。肿瘤内TAM计数与CRC肿瘤恶性程度相关[20]，肿瘤组织中TAM的计数高于癌旁组织。CD163+巨噬细胞M2表达与K-ras突变有相关性。K-ras突变驱动具有M2 TAM极化的免疫抑制性肿瘤微环境。巨噬细胞M2可能参与或影响K-ras的突变路径，M2巨噬细胞增加与K-ras突变可能性增加相关，这将为CRC的病情进展评估提供参考。

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（收稿日期：2018-12-20）