影响胚胎种植率关键因素的研究进展

高戈，张云山

体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilizationembryotransfer，IVF-ET）技术开展40年至今，已成为临床治疗不孕症最为有效的手段，但其胚胎着床率仅为20%～30%[1]。自1978年首例试管婴儿出生以来，低种植率始终是生殖医学领域尚未解决的问题之一，也是限制人类辅助生殖技术发展的瓶颈，而且反复植入失败更会对患者及家庭造成沉重的经济负担和精神压力，同时增加临床医生的工作负荷。目前，世界范围内，为减少多胎妊娠，选择性单胚胎移植正逐渐取代多胚胎移植成为一种趋势，因此提高种植率的意义显得尤为重要。现结合近年来国内外相关研究成果对影响胚胎种植率的关键因素进行综述。

1 胚胎质量

胚胎本身的质量无疑是影响胚胎种植率的关键因素之一，如何从众多胚胎中挑选出最具发育潜能的胚胎用于移植是IVF实验室的胚胎学家们一直以来最为关心的问题。目前世界上绝大多数IVF实验室采用的仍然是“试管婴儿之父”Robert Edwards教授于1970年提出的传统的形态学评估的方法，从细胞数量、碎片率以及均一性等方面来评价胚胎[2]。随着研究的深入和技术的发展，胚胎学家们认识到传统的形态学评估由于只是在固定的几个时间点对胚胎进行观察，因此并不能完全反映胚胎发育潜能的真实情况，一些用于挑选优质胚胎的新技术和新方法可能更为有效。

1.1 缩时摄影（Time-lapse）技术 Time-lapse技术即每隔一段固定时间（如5 min或者10 min）对胚胎进行一次拍照，然后将拍摄的照片按时间顺序制作成影片，以此来反映胚胎的动态发育过程。1997年，Payne等[3]首次运用该技术对胞浆内单精子注射（ICSI）授精后的胚胎发育进行观测，结果表明不同卵母细胞极体出现、原核形成及消失的时间明显不同，在优劣胚胎中有显著差异。

Time-lapse技术较传统的形态学评估的优势是不需要将胚胎拿出培养箱，一定程度上避免了温度、pH值、CO2浓度等突然发生变化对胚胎发育的影响，同时可以结合不同指标（如双极体出现的时间，原核出现及消失时间，胚胎发育到2细胞、3细胞、4细胞、5细胞阶段分别的用时，囊胚腔出现时间，囊胚开始扩张及孵出时间等）对胚胎发育进行动态形态学评估[4]。同时这项技术也属于非侵入性操作，不需对胚胎进行活检。

目前Time-lapse技术同样存在一些问题，首先由于拍照而造成的光暴露对胚胎发育是否存在负面影响仍无定论；其次，其造价高昂且在分析时相比传统形态学评估更加耗时；再次，其动态评估参数并没有统一标准，且对其实际效果是否优于传统形态学评估仍存争议[5-8]。

1.2 植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS） 高龄、反复流产、反复植入失败、严重男性因素不孕患者因为染色体非整倍体发生率增高，学术界提倡对这部分人群进行PGS，目的是筛查23对染色体非整倍体，将更具发育潜能的整倍体胚胎用于移植，降低流产风险，提高活产率[9-11]。其原理是在胚胎发育到第3天时对胚胎进行激光打孔，然后在第5天或者第6天时取从激光打孔处孵出的少量外滋养层细胞进行活检，活检方法从过去的荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）到后来的微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization，aCGH），再到目前主流的高通量测序（next generation sequencing，NGS）[12-13]。

2015年，一些IVF中心报道不经选择对所有IVF患者进行PGS显著提高了妊娠率[14]。有研究显示，经PGS筛查后的高龄（≥38岁）女性胚胎种植率、活产率与不经PGS筛查的对照组相比显著提高，流产率明显降低[15]。PGS结合囊胚移植可显著提高妊娠率、持续妊娠率、活产率，降低流产率和多胎风险，在高龄和反复流产的患者中具有较好的临床效果[16-18]。随着NGS技术的发展，特别是其成本的大幅度下降，其在PGS中的大范围应用取得了令人满意的效果[19-21]。近年来，一些学者更是致力于无创PGS的研究，如通过对胚胎培养液中游离DNA进行检测取代胚胎活检，尽管取得了一些成果[22-23]，但其敏感度和特异度仍有待提高，且距临床大范围推广仍存较大差距。

PGS技术目前仍存在一些颇具争议的问题，首先，目前世界上绝大部分IVF实验室采用的活检方法仍属于有创操作，可能带来胚胎损伤、植入潜能下降、表观遗传变化及成年后可能的远期影响，目前尚缺乏充分的研究数据证明其远期的安全性；其次，PGS仍然无法预知嵌合体胚胎的结局，随着NGS在PGS中的应用，嵌合体胚胎的诊断率提高，但对于嵌合体胚胎是否可以移植的问题尚无定论；再次，PGS并不能改善可用胚胎质量，也不能增加可移植胚胎数量，同时增加了患者的经济成本，因此是否应该扩大其适用范围，不加选择地对所有IVF患者进行PGS目前仍存在较大争议[24]。

2 子宫内膜容受性（endometrial receptivity）

近年研究表明，子宫内膜容受性是除胚胎质量外的另一影响胚胎种植率的决定性因素。2006年有学者研究发现，60%的胚胎种植失败应归咎于不合适的子宫内膜容受性[1]。2015年Galliano等[25]的研究再次证实，至少有25%的患者的子宫内膜种植窗口期（window of implantation，WOI）会提前、延后或比通常的窗口期更短。因此根据个体化的WOI进行移植，特别是对那些反复植入失败的患者来说显得十分必要。基于此，科学家们一直致力于寻求一种简便且能够精准预测WOI的方法。

1950年，Noyes等[26]描述了排卵后子宫内膜的时相变化，关于子宫内膜活检组织学分期的这一研究在当时被认为是评估子宫内膜分化和成熟程度的“金标准”，但随后的研究发现，此项技术在评估子宫内膜容受性方面具有一定的局限性，并不准确；“胞饮突”也曾被认为是在窗口期子宫内膜发生形态学改变的最佳标志物，但随着研究的深入，越来越多的学者对“胞饮突”提出质疑，认为“胞饮突”在黄体期持续时间超过5 d，不能准确描绘WOI[27]。

近期研究显示，有多个基因在子宫内膜各个时期的表达谱有明显差异[28]，例如编码外周血雌孕激素、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、黏蛋白1（mucoprotein-1，MUC-1）、细胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAMs）、肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）的基因，这些基因被认为是检测子宫内膜容受性潜在的生物学标记物；不仅如此，一些研究离子通道的科学家还发现，WOI的出现与囊性纤维化跨膜通道调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）、 上 皮 细 胞 钠 通 道（epithelial sodium channel，ENaC)、电压依赖性钙通道（voltage dependent calciumchannel，VDCC）以及瞬时受体电位通道（transient receptor potential channel，TRP）等多种离子通道有关[29]。

来自西班牙瓦伦西亚大学生殖医学研究院的研究团队通过比较子宫内膜自然状态与超排卵的基因表达谱发现，超促排卵技术对WOI有影响，造成移植成功率降低[30]。他们通过对比自然状态子宫内膜不同时期基因表达谱，将238个可能与子宫内膜容受性相关的基因制作成基因芯片，通过相关临床试验证实子宫内膜容受性芯片（endometrial receptivity array，ERA）的准确性要优于传统组织学活检[31-34]。有学者通过一种间接的免疫荧光法来测定核仁管系统（nucleolar channel system，NCS）预测WOI，其结果与ERA的准确性相当[35]。上海交通大学附属仁济医院的研究团队采用二代测序技术，对自然周期女性黄体生成激素（LH）峰值后第2天（LH+2）和第7天（LH+7）的子宫内膜组织进行了转录组测序 的 比 较 ， 证 实 GLI2、CDC25A、TLR9、MT1G 和SLC5A1等基因与子宫内膜容受性有关[36]。

尽管各项对子宫内膜容受性和种植窗口期的研究取得了一定成果，但目前仍存在一些问题。首先，目前绝大多数针对子宫内膜容受性的研究集中于内膜组织本身，因此，如想在ET前对WOI进行预测就需要提取内膜组织，这种有创操作可能会对后续胚胎着床造成负面影响。其次，目前针对子宫内膜容受性的研究方法集中于转录组学，特别是基因芯片技术，尽管高通量、自动化基因芯片技术已经比较成熟，使生物学标记物的筛选及鉴定有了重大突破，但基因的表达水平与活性蛋白质的量之间并不是简单的线性关系，从基因转录到翻译再到蛋白质最终执行功能受到多级水平的调控。因此，未来对于WOI生物学标记物的研究如果从子宫内膜组织转向血清、从转录组转向蛋白质组可能会取得更重要的突破。

3 结语

IVF-ET经过40年的发展，衍生出如ICSI、PGS、Time-lapse、ERA等新的技术手段，随着这些新技术在胚胎挑选以及个体化ET中的应用，胚胎种植率以及IVF-ET的成功率将不断提高。同时，伴随干细胞治疗在子宫内膜修复和治疗卵巢功能早衰中的成功应用[37-38]，以及为治疗线粒体遗传疾病而诞生的“三亲”试管婴儿技术，IVF-ET的治疗范围将进一步扩大。尽管基因编辑技术在人类生殖细胞中的应用引发了巨大争议，但不可否认，随着CRISPR-Cas9[39]等基因编辑技术的出现，未来人们对IVF-ET的期望也将逐渐从“能生”转变为“优生”，尽管在技术层面以及医学伦理问题上还将有相当长的一段路要走，但随着科学技术的不断发展，IVF-ET必将迎来更大发展。