Sirtuins在生殖领域的新兴作用和治疗潜力

何元曼，杜惠兰

Sirtuins是酵母沉默信息调节因子2（Sir2）的哺乳动物同源蛋白质，1999年Kaeberlein等[1]发现Sir2高表达可延长酵母菌寿命，此后Sir2在哺乳动物中的同源物Sirtuins逐渐被发现。Sirtuins是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的去乙酰化酶，具有脱乙酰酶活性，主要通过催化组蛋白底物的乙酰赖氨酸进行去乙酰化反应，去除蛋白质乙酰基团，改变其位置及功能。Sirtuins参与糖脂代谢、炎症信号、氧化应激等，并且与衰老和寿命有关[2-3]。越来越多的研究发现，Sirtuins影响新陈代谢和寿命的能力取决于其脱乙酰酶的活性。

目前发现Sirtuins家族包括7个成员，分别为沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，Sirt1）～Sirt7，每个成员具有不同的组织特异性、亚细胞定位、酶的活性和目标[4]。Sirt1、Sirt6、Sirt7主要定位在细胞核，Sirt2定位在细胞质，Sirt3、Sirt4和Sirt5定位于细胞线粒体。2003年研究发现敲除Sirt1的雄性和雌性小鼠分别出现生殖表型缺陷[5]，此后Sirtuins在调节哺乳动物生殖功能方面的作用逐渐备受关注，近年来人类对Sirtuins在生殖功能方面的研究呈指数增长[6]。Sirt1参与DNA修复、衰老及凋亡等过程；Sirt2、Sirt6参与微管的组装，参与卵母细胞分裂进程；Sirt3是研究最多的线粒体蛋白，影响关键的线粒体功能，可调节细胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成与清除以及三磷酸腺苷（ATP）产生等，起到抗氧化损伤的作用；Sirt4、Sirt5、Sirt7在生殖领域的研究相对较少。

现代女性初孕年龄日渐推迟，因卵泡储备的周期性丢失及卵泡质量的下滑，女性卵巢随年龄增加逐渐走向衰老，卵巢衰老已成为阻碍高龄女性获取正常妊娠的关键因素。以往研究表明，先天因素、环境因素、氧化应激损伤的累积均可导致女性卵巢衰老；另外，随着不孕患者的日益增加，体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技术日渐普及。在IVF-ET治疗过程中，有些患者不能通过一次取卵获得成功，反复促排卵及体外培养周期中引发的卵母细胞氧化应激状态对卵母细胞质量的损伤不容忽视；女性高能量饮食及缺乏身体锻炼的普遍生活方式，给女性生殖系统带来压力。卵巢衰老、卵母细胞氧化应激、高热量饮食等导致的生殖缺陷正在挑战着现代女性生育力。寻求提高女性生育力的对策成为医学生殖领域有待解决的重要任务。

Sirtuins广泛参与调控生殖系统疾病。近几年在生殖疾病领域，Sirtuins家族正在成为新的研究热点。Sirtuins参与卵母细胞减数分裂成熟、线粒体功能调节、氧化应激及卡路里限制（caloric restriction，CR），发挥其抗衰老和抗应激作用，对卵母细胞、颗粒细胞（granulosa cell，GCs）、植入前胚胎及雄性生殖细胞具有益影响。

1 Sirtuins参与卵母细胞减数分裂

人类从出生至青春期之前，卵母细胞的发育停滞在生发泡期（GV期），直至青春期，在黄体生成激素（LH）的刺激下，卵母细胞发育重新启动，在生发泡破裂（GVBD期）后，进入第一次减数分裂（MⅠ期），初级卵母细胞排出第一极体（PB1），形成次级卵母细胞，随后进行第二次减数分裂，并再次停滞于第二次减数分裂中期（MⅡ期）等待受精，若成功受精，卵母细胞继续进行第二次减数分裂，若未受精，卵母细胞继续发育至老化。卵母细胞在两次减数分裂过程中，细胞质内的微管组装成特殊的桶状纺锤体，染色体在纺锤体赤道板规则排列，正确的纺锤体组装和染色体排列是产生健康卵母细胞的重要条件。

在哺乳动物的老化卵母细胞中，Sirtuins表达降低导致纺锤体缺陷和染色体错位的频率增加，高表达Sirtuins可改善卵母细胞减数分裂。如猪体外培养的老化卵母细胞中Sirt1表达显著降低，纺锤体缺陷和染色体错位的频率增加，Sirt1激动剂白藜芦醇可改善这些变化[7]。Zhang等[8]研究Sirt2对小鼠体外老化卵母细胞减数分裂的影响，得出了与Sirt1相似的结论，纺锤体维持和染色体运动之间的协调在很大程度上依赖于动粒微管动力学，Sirt2诱导α-微管蛋白和组蛋白H4K16的高乙酰化，损害微管稳定性和动粒功能。2015年，Riepsamen等[9]和Zhang等[10]发现，抑制Sirtuins活性可影响小鼠卵母细胞第一次减数分裂后期纺锤体的组装，降低猪卵母细胞第一极体排出率，进一步证实了Sirtuins对卵母细胞减数分裂的影响。同年研究发现，Sirtuins家族中Sirt3、Sirt6低表达均可破坏小鼠卵母细胞纺锤体形态和染色体排列[11-12]。总之，Sirtuins家族大部分成员参与卵母细胞减数分裂，Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt6高表达可改善哺乳动物卵母细胞减数分裂，且Sirt1、Sirt2高表达显著改善哺乳动物老化卵母细胞质量，因此，Sirtuins激动剂在临床的应用可能具有改善高龄女性卵母细胞质量，延缓女性生殖寿命的潜在治疗作用。

2 Sirtuins参与调节线粒体功能

卵母细胞是人体含有线粒体最多的细胞，线粒体是卵母细胞内最为丰富的细胞器，线粒体被誉为细胞的“能量工厂”，三羧酸循环通过线粒体的电子传输链（ETC）合成ATP，参与细胞生长、增殖、凋亡等；线粒体具有产生和清除ROS的能力，当线粒体功能发生障碍时，其清除ROS的能力减弱，细胞内ROS累积使线粒体DNA（mtDNA）氧化损伤，线粒体生物合成减少，影响卵母细胞及早期胚胎的正常发育。

近几年研究证实Sirtuins可翻译后修饰蛋白质以响应代谢状态的变化，并参与调节线粒体功能。在体外培养牛卵母细胞或猪卵母细胞的培养基中加入白藜芦醇，可上调Sirt1的表达，增加线粒体ATP含量、线粒体膜电位及mtDNA数目，通过促进卵母细胞线粒体生物合成及调节能量稳态，改善线粒体功能，提高卵母细胞发育能力，并可通过阻断多精子受精的机制，改善受精结局[13-14]。Sirt3作为线粒体蛋白可指导线粒体能量产生或调节活性氧清除蛋白[15]。2016年，Zhao等[16]对接受辅助生殖治疗患者的卵母细胞进行研究发现，Sirt3 mRNA高表达可增加体外成熟（in vitro maturation，IVM）卵母细胞mtDNA的拷贝数，促进线粒体生物合成，提高从卵母细胞到囊胚的发育潜能，由于伦理限制，获取大量人卵母细胞存在难度，因此对大量小鼠卵母细胞做进一步研究，证实了Sirt3有改善体外培养MⅡ期卵母细胞质量和卵母细胞到囊胚的发育潜能的作用。在未来人类辅助生殖过程中，Sirtuins激动剂的应用可能成为临床改善IVM卵母细胞质量的潜在治疗靶点。

3 Sirtuins参与卡路里限制延长女性生殖寿命

有研究表明，卡路里限制是唯一一种非遗传干预，可延缓成年大鼠卵巢功能衰竭[17]。2012年Luo等[18]提出卡路里限制抑制原始卵泡到发育卵泡的过渡，延长了卵泡的整个生长阶段，保存了生殖细胞的储备，可能与Sirt1和Sirt6有关。后来有研究证实了Sirtuins与卡路里限制的关系，卡路里限制通过激活剂Sirt1720激活Sirt1及其下游底物叉头框转录因子O3a（FOXO3a）、上调转录因子NF-E2相关因子1（Nrf1）及Sirt6的表达，或通过激活Sirt1及抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号转导，提高雌性小鼠卵泡储备，延长饮食性肥胖的卵巢寿命[19-20]。

4 Sirtuins参与卵母细胞氧化应激

ROS的积累引起的氧化应激是导致卵母细胞质量下降和衰老的主要原因。线粒体作为产生ROS的场所也是氧化损伤的优先靶点，线粒体功能障碍所产生的氧化应激会影响卵母细胞正常发育。

Sirt1、Sirt3通过增加抗氧化酶活性调节氧化还原系统环境，抵消氧化损伤。Sirt1通过上调FoxO3a-锰超氧化物歧化酶（MnSod）轴在针对ROS的前线防御中起作用[21]。Sirt3定位于小鼠卵母细胞线粒体，可脱乙酰化超氧化物歧化酶2（SOD2），增加SOD2活性，对卵母细胞的氧化应激和减数分裂缺陷起保护作用[22]。

女性排卵后，卵母细胞减数分裂停滞在MⅡ期等待受精，此过程卵母细胞易受温度、ROS等因素影响，发生老化。Sirt1、Sirt2和Sirt3可控制小鼠排卵后的ROS生成，减少卵母细胞氧化损伤，被认为是排卵后防止卵母细胞老化的保护剂。陆续有研究发现，咖啡因、槲皮素和褪黑素可延缓小鼠排卵后卵母细胞衰老。咖啡因通过延缓卵母细胞Sirt1，2，3 mRNA水平的下降及增加成熟促进因子（mature promoting factor，MPF）活性阻止排卵后卵母细胞的老化[23]；Wang等[24]发现槲皮素与咖啡因具相似功能。近几年发现，褪黑素对衰老及肥胖引起的氧化应激有保护作用，其机制可能与Sirt3-SOD2依赖途径有关[25-26]。随后又证实，褪黑素通过Sirt1-锰超氧化物歧化酶（MnSod）依赖途径延缓小鼠排卵后卵母细胞的衰老[27]。Sirt7主要积聚在GV期的细胞核中，敲除Sirt7导致小鼠卵母细胞ATP水平降低，ROS产量增加，影响细胞减数分裂，损害卵母细胞及早期胚胎的发育潜力[28]。总之，Sirtuins为反复促排卵引起卵母细胞氧化应激及排卵后老化患者提高卵母细胞质量提供了新的治疗思路。

5 Sirtuins与颗粒细胞

颗粒细胞是组成卵泡的最大细胞群，以自分泌和旁分泌的方式调节卵泡的生长、发育和成熟，颗粒细胞通过复杂的缝隙连接与卵母细胞之间形成信息通讯，维持卵母细胞成熟的微环境及黄体功能，颗粒细胞的完整性保护卵母细胞免受体外氧化损伤，其凋亡使卵母细胞更易发生凋亡[29]。Han等[30]发现Sirt1在人颗粒细胞中的表达随着年龄的增长及卵巢功能的减退逐渐降低，Sirt1通过激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途径和抑制具有抗炎功能的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），介导卵巢颗粒细胞对凋亡的抵抗，激活Sirt1或许可成为开发新型抗炎疗法的新途径。另一方面，有研究提出Sirt1具有促颗粒细胞凋亡作用[31-32]。2014年日本东京大学研究团队发现敲除Sirt3可提高人颗粒细胞中ROS的生成，Sirt3缺失减少孕酮的分泌，因此Sirt3通过调节颗粒细胞ROS水平及孕酮的分泌在卵泡发生和黄素化进程中发挥积极作用[33]。2016年李碧侠等[31]对猪颗粒细胞研究发现，Sirt1基因表达量的变化可改变猪颗粒细胞卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E2）、LH的敏感性。Sirt1、Sirt3不仅抑制颗粒细胞凋亡，二者对颗粒细胞生殖激素的调控作用使人猜想，Sirt1、Sirt3的激活可能发挥似黄体支持的作用。

目前，Sirtuins对雄性生殖系统影响的研究主要集中在Sirt1。Sirt1缺乏导致成年小鼠成熟精子数量减少、生精细胞数量减少，附睾精子DNA损伤率明显增高[34]。特异性敲除Sirt1基因后，小鼠生殖细胞在组蛋白到鱼精蛋白转变和染色质凝聚方面存在缺陷[35]。Sirtuins与雄性生殖功能关系的研究有待拓展。

6 结语与展望

综上所述，Sirtuins通过多方向靶点参与调控哺乳动物生殖功能。2018年Tatone等[6]提出Sirtuins调节剂对于改善女性多囊卵巢综合征、糖尿病、子宫内膜异位症、外源性应激以及与老化相关的不孕症具有治疗潜力。未来Sirtuins激动剂在临床的应用，或许为延缓高龄女性或卵巢储备功能低下患者的生殖寿命、减少排卵后卵母细胞老化、针对黄体功能不全患者补充黄体功能、对抗体外受精周期中卵母细胞面临的氧化应激压力等提供了新的治疗思路和方法，Sirtuins可能在未来生殖医学领域具有很大的治疗潜力。