mTOR与卵泡发育

朱静，杨庆岭，孙莹璞

哺乳动物卵巢是由黄体及处于不同发育阶段的各级卵泡组成的异质性器官。胎儿期卵巢内卵母细胞逐渐停止有丝分裂，进入第一次减数分裂并静止在双线期，双线期的卵母细胞被单层扁平前颗粒细胞（primordial follicle granulosa cells，pfGCs）包围形成原始卵泡[1]，构成女性基本生殖单位，原始卵泡库的大小一定程度上决定了个体的生育年限[2]。妊娠20周时胎儿原始卵泡的数目峰值可达六百万至七百万，此后逐渐下降，出生后卵巢中原始卵泡不到一百万[3]。性成熟后，在下丘脑－垂体－卵巢轴的影响下，体内性激素水平发生改变，部分处在静止期的原始卵泡被募集，伴随着pfGCs的增殖分化卵母细胞进一步发育，最终形成卵丘细胞－卵母细胞复合体并完成排卵。成年女性每个月经周期约有1 000个卵泡被募集，但只有极少数卵泡能够完成排卵，绝大多数在发育过程中闭锁[4]。

1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的生物学功能

mTOR是由mTOR基因编码的非特异性丝/苏氨酸激酶。在哺乳动物细胞中，mTOR分子与其他亚基结合形成mTOR复合体（mTORC）发挥其功能。mTOR所结合的亚基有mTORC1和mTORC2两种形式。mTORC1由核心亚基mTOR、Raptor、mLST8及非核心亚基PRAS40、DEPTOR、Tel2共6个亚单位组成。mTORC1的活性主要受受体酪氨酸激酶（receptor tyrosinekinase，RTKs）信号通路调节。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGF）作用于细胞膜表面RTKs，激活其下游蛋白激酶B（protein kinases B，PKB/AKT）， 使 结 节 硬 化 复 合 物 2（tuberous sclerosiscomplex 2，TSC2） 磷酸化并与TSC1分离，解除异二聚体复合物TSC1/TSC2对mTORC1的抑制，激活mTORC1。此外，IGF1也可通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路解除TSC1/TSC2复合物对mTORC1的抑制。磷酸化的mTORC1作用于其下游分子40S核糖体S6蛋白激酶1（S6K1）及真核启动因子4E结合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4Ebinding protein 1，4E-BP1），激活细胞内转录和翻译过程，促进细胞生长发育[5]。mTORC2除含有mTOR、mLST8、DEPTOR和Tel2 4个亚基外，还含有mSin1和RicTOR 2个亚单位。一般认为mTORC2是雷帕霉素非敏感性受体，雷帕霉素的瞬时暴露不会引起mTORC2的激活及AKT磷酸化水平的增加，但长时间暴露于雷帕霉素可引起肿瘤组织及一些正常组织中mTORC2活性增加。mTORC2主要通过调节纤维性肌动蛋白（F-actin）的组装与极化影响细胞骨架的形成，从而发挥其生物学效能[6]。mTORC2也受IGFⅠ受体（IGF-ⅠR）、胰岛素受体（insulin receptor，InsR）、AKT以及血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1（serum-and glucocorticoid-induced protein kinase-1，SGK-1）的调节，影响细胞增殖及新陈代谢[7]。

目前对哺乳动物卵巢mTOR分子的研究主要集中在mTORC1及其下游分子与原始卵泡激活之间的关系，以及其对女性生育力保护的临床意义。

2 mTOR分子与原始卵泡激活

包围卵泡的pfGCs转化为单层柱状颗粒细胞是原始卵泡激活的形态学标志，原始卵泡的激活是一个渐进过程，大多数卵母细胞保持静息状态，仅少数卵泡被激活，继续发育完成排卵[4]。在遗传或环境因素影响下，原始卵泡可过度激活，引起原始卵泡库过早耗竭，导致卵巢储备能力下降，女性生育年限缩短[8]。人类卵巢组织的全基因组关联性研究表明，卵巢功能不全与多种基因突变有相关性[9]。因此寻找静止期卵泡激活的分子机制并改善其过度激活是保护女性生育力的重要途径。同时有研究证明，对于卵巢储备能力较低（如卵巢功能不全）的患者，体外应用激活剂诱导静止期卵母细胞及前颗粒细胞激活后将卵巢组织自体移植，可以增加患者获卵数，改善辅助生殖治疗结局[10-11]。

人卵巢组织差异基因表达分析显示，在原始卵泡向初级卵泡转化过程中卵母细胞及颗粒细胞mTOR信号通路表达均上调，提示原始卵泡激活与mTOR信号网络存在相关性[12-13]。对啮齿类动物的研究显示，mTOR分子在原始卵泡静止期卵母细胞的发育及前颗粒细胞的增生中起重要作用[14-16]。研究表明，无论是年龄增长引起的卵巢储备功能下降或是化疗药物导致的卵巢功能不全，应用mTOR抑制剂雷帕霉素均能抑制原始卵泡的激活，延长小鼠生育年限[17-19]。并且，体内应用雷帕霉素能够改善小鼠卵子质量及卵巢微环境[20]。相反，mTOR激活剂的使用，在体内外均能够显著增加小鼠原始卵泡向初级卵泡转化[21]。2013年Kawamura等[10]将原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）患者的卵巢组织在体外添加AKT激活剂培养后，自体移植入患者体内，经过促排卵获得了成熟卵子。研究发现，激活前颗粒细胞中mTOR通路能够启动原始卵泡激活，在卵巢组织体外激活过程中，辅助添加mTOR激活剂可能对增加POI患者的获卵数、改善辅助生殖助孕结局具有积极意义[16]。此外，联合应用磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和mTOR激活剂对卵巢早衰患者卵泡的激活具有协同效应[22]。

卵母细胞或pfGCs中mTOR的异常表达均可破坏卵泡的周期性募集，导致原始卵泡池过早耗竭，对女性的生育力造成不可逆的损伤。因此，探索静止期卵泡激活的分子机制对于女性生育力的保护以及不孕患者的临床治疗均具有重要意义。

3 mTOR与卵母细胞发育

具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性的PI3K及下游分子AKT是静止期卵母细胞激活的经典信号分子，通过影响其庞杂的下游信号网络，促进静止期卵母细胞活化。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphataseand tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）编码的蛋白具有磷酸酶和磷脂酰肌醇磷酸酶特异性双重催化作用。PTEN可使磷脂酰肌醇3磷酸[PtdIns（3，4，5）P3]去磷酸化转化为磷脂酰肌醇2磷酸[PtdI ns（4，5）P2]，对PI3K/AKT信号通路产生负调节作用[23]。

为进一步明确静止期卵母细胞激活的分子机制，Reddy等[24]利用Cre/loxP重组酶系统，将PTENloxP/loxP小鼠与表达生长分化因子9（growth differentiation factor 9，Gdf-9）启动子介导的重组酶Cre转基因小鼠杂交，筛选获得卵母细胞中特异性敲除PTEN基因的小鼠（PTENloxP/loxP;GCre+）。观察发现出生后5 d（PD5）及35 d（PD35）PTENloxP/loxP;GCre+小鼠卵巢体积及卵巢内初级卵泡数量较PTENloxP/loxP小鼠明显增加，提示原始卵泡库中大量卵泡被激活。由于原始卵泡库过早耗竭，12周龄时，PTENloxP/loxP;GCre+小鼠丧失生育能力，血清中卵泡刺激素（FSH）及黄体生成激素（LH）水平较PTENloxP/loxP小鼠显著升高，出现卵巢早衰表型；至16周龄时，与PTENloxP/loxP小鼠相比，PTENloxP/loxP;GCre+小鼠提前出现卵巢萎缩、退化，正常组织形态消失。分别分析PD5及PD12～14 PTENloxP/loxP;GCre+小鼠卵巢组织蛋白表达情况显示，在原始卵泡被广泛激活的时期，卵巢中mTOR及其下游分子S6K1、rPS6磷酸化水平明显上调，提示mTOR在原始卵泡库的维持及激活过程中发挥一定作用。

异二聚体复合物TSC1/TSC2是mTORC1信号通路的上游抑制因子。研究发现，条件性敲除小鼠卵母细胞中的TSC1或TSC2基因，解除TSC1/TSC2对mTORC1的上游抑制作用后，小鼠在12～13周龄时即丧失生育能力，16周龄时卵巢已发生萎缩、退化，而对照组小鼠出生后27周仍保有生育能力[14-15]。不同发育阶段人卵泡液差异基因表达分析也证实，在原始卵泡激活过程中卵母细胞内mTOR基因表达上调[12]。近期有学者发现，原始卵泡中的卵母细胞并非处于完全“休眠”状态，其mTOR信号网络系统表达活跃，由于卵巢中卵母细胞的发育阶段不同，仅将原始卵泡中静止期卵母细胞mTOR基因特异性敲除后可导致卵子质量异常甚至不孕；而生长期卵母细胞mTOR基因缺失仅导致生殖细胞减数分裂进程异常，卵子受精及早期胚胎发育潜能降低，表明静止期卵母细胞中mTOR信号通路在女性不孕的发生、发展中起重要作用[25]。

4 mTOR与颗粒细胞激活

原始卵泡激活早期，pfGCs增殖分化并完成形态和数量变化。pfGCs与卵母细胞的胞间信息交流对原始卵泡激活十分重要[26]。有学者发现，在小鼠初级卵泡颗粒细胞体外培养过程中添加mTOR抑制剂后，颗粒细胞的增殖率呈剂量依赖性下降；且雷帕霉素处理后停滞在有丝分裂G1期的颗粒细胞比例也呈剂量依赖性增加，仅小部分颗粒细胞进入分裂期，且细胞分裂异常，抑制颗粒细胞活化[27-28]。而将小鼠卵巢颗粒细胞中TSC1基因特异性敲除后，颗粒细胞内mTOR及其下游分子rPS6磷酸化水平增加，初级卵泡及排卵数增加，提示颗粒细胞内mTOR信号通路的过度激活与原始卵泡的激活密切相关[29]。利用Cre/loxP重组酶系统特异性切除编码小鼠原始卵泡pfGCs中mTORC1的Raptor亚基基因后，mTORC1信号通路被抑制，卵泡激活水平显著降低。而特异性敲除前颗粒细胞TSC1基因后，mTORC1信号通路迅速激活，并伴有大量初级卵泡形成，表明mTOR分子在原始卵泡库维持中起重要作用[16]。有学者对人卵巢原始卵泡及初级卵泡的颗粒细胞进行基因差异表达分析后发现，在原始卵泡向初级卵泡转化过程中，包括mTOR基因在内的294种基因片段表达上调[13]。

5 结语

综上所述，mTOR信号网络与卵母细胞及颗粒细胞激活密切相关，可从多方面调节原始卵泡库激活，与女性生育力密切相关。一方面，体内抑制其过度激活，能够抑制原始卵泡的发育，减缓患者卵巢储备能力下降的速度，延缓女性卵巢衰老；另一方面，对于卵巢功能较差的患者，体外激活卵巢组织过程中联合应用mTOR激活剂对改善辅助生殖妊娠结局有积极意义。目前，有关mTOR与卵泡发育的相关研究多局限于实验动物模型，mTOR分子在人卵巢原始卵泡激活过程中的调控机制尚未明确。随着研究的不断深入，mTOR信号网络调控原始卵泡激活及女性生殖分子机制进一步明确，mTOR信号网络系统将有望成为女性生育力保护甚至卵巢组织体外激活的新靶点，为女性不孕的诊疗提供新思路。