LncRNAs与miRNAs在非梗阻性无精症中的研究进展

田成成，宋文妍

非梗阻性无精症（non-obstructive azoospermia，NOA）是目前男性生殖领域研究的热点之一。NOA约占成年男性的1%，占不育男性的10%～15%[1]，非染色体性的NOA病因复杂，发病机制尚不清楚，尤其是决定NOA患者生精数量的分子机制仍需进一步阐明。精子生成过程中基因缺失、突变或表达异常都可能引起精子生成障碍，导致男性不育症。近年随着对男性生殖领域的研究深入以及高通量测序技术的发展，对于NOA的病因及治疗有了一些新的认识。目前已发现许多非编码RNA，如长链非编码RNAs（lncRNAs）、微小RNAs（miRNAs）、小干扰RNA（siRNA）、与Piwi蛋白相作用的RNA（piRNA）等参与雄性生殖的调节[2]。本文综述lncRNAs与miRNAs在精子发生过程中的表达与作用机制。

1 LncRNAs

1.1 LncRNAs概述及作用机制 LncRNAs占非编码RNA的80%，为长度大于200个核苷酸的调控性非编码RNA，其可以是已知基因的反义转录物、内含子的转录物，也可以转录自基因间隔区、假基因或转座子等序列[3]。LncRNAs通过转录、转录后修饰的表观遗传水平的多种机制调节基本的生化和细胞过程。主要作用方式包括：①lncRNAs可与转录因子相互作用以干扰转录；②lncRNAs可吸附miRNAs并阻止随后的miRNAs对mRNA的抑制作用；③lncRNAs可直接与蛋白质相互作用以调节蛋白质活性，改变蛋白质定位，或影响蛋白质的结构或组织作用；④lncRNAs可以募集染色质修饰因子来改变染色质修饰水平，然后影响基因的表达；⑤lncRNAs可直接与mRNA相互作用以抑制翻译，调节可变剪接模式或影响mRNA的稳定性[4]。LncRNAs具有空间、时间和系谱特异性，可通过其亚细胞定位确定的顺式和反式作用机制参与转录和转录后调控。定位于细胞核中的lncRNAs参与表观遗传修饰和重复DNA元件的转录调控，通过RNA聚合酶Ⅱ调节蛋白质编码基因的转录。此外，lncRNAs直接通过转录因子调节靶基因的转录[5]。定位于细胞质中的lncRNAs负责转录后调节和相关的内源性调节机制，这些竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）充当miRNAs海绵或mRNA结合竞争者。此外，细胞质中的lncRNAs可能参与蛋白质稳定性加工，还可以与RNA结合蛋白（RBP）相互作用，调节信号转导途径[6]。

1.2 LncRNAs与精子发生 从细胞水平来讲，精子发生经历多个阶段，包括精原干细胞增殖和分化、精原细胞、精母细胞、精子细胞和成熟精子阶段。从分子水平来讲，精子发生的调控包括转录及转录后翻译、修饰等。随着高通量测序技术的发展，发现lncRNAs在睾丸高度富集，并在精子发生中阶段特异性地表达。Lü等[7]对NOA和正常睾丸内lncRNAs的表达谱分析表明：在这两种表型患者中分别有757个及2 370个lncRNAs表达下调，475个及163个lncRNAs表达上调。提示lncRNAs在精子发生不同阶段的表达谱各异，且与哺乳动物精子发生有着密切联系。

LncRNAs已被确定为干细胞命运的关键调节因子。精原干细胞（SSCs）是独特的雄性生殖系干细胞，支持精子发生。Li等[8]发现一种新的精原细胞特异性lncRNA，lncRNA033862是小鼠SSCs存活的必要条件，调控神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF），而GDNF是SSCs自我更新和存活所需的生长因子。LncRNA033862是GDNF受体α1（Gfra1）的反义转录物，其缺乏编码蛋白质潜力并通过与Gfra1染色质相互作用来调节Gfra1表达水平，进而调控SSCs的自我更新和存活。在敲低了lncRNA033862的SSCs中，其存活率明显下降[8]。Hu等[9]发现lncRNA AK015322在小鼠SSCs中高表达；AK015322在体外促进小鼠精原干细胞系C18-4的增殖。通过生物信息学分析、定量聚合酶链反应（PCR）和双荧光素酶测定，验证了lncRNA AK015322通过ceRNA作用与miR-19b-3p结合，拮抗miR-19b-3p功能，并减弱miR-19b-3p对转录因子Ets差异基因5（ETV5）的抑制，而ETV5是SSCs自我更新的关键基因。

LncRNA Gm2044在小鼠精母细胞中丰富表达。未分化转录因子1（undifferentiated transcription factor 1，UTF1）是早期精原细胞的关键分子标记，介导PTEN信号通路维持SSCs的功能[10]。LncRNA Gm2044可通过与Utf1 mRNA相互作用抑制相邻精子发生相关基因Utf1的翻译，影响精原细胞的分化及精母细胞的减数分裂过程。此外，lncRNA Gm2044还可抑制小鼠精原细胞GC-1细胞系和精母细胞GC-2细胞系的增殖，表明lncRNA Gm2044具有调节精子发生中生殖细胞命运的能力[11]。睾丸特异性lncRNA-HSVⅢ在粗线期精母细胞中表达，lncRNA-HSVⅢ与Prss42/Tessp-2的启动子相互作用，能增强Prss42/Tessp-2启动子的活性，Prss42/Tessp-2在粗线期精母细胞的减数分裂过程中被特异性激活，其表达缺失将导致减数分裂被阻滞，细胞凋亡增加[12]。NLC1-C（narcolepsy candidate-region 1 genes C）是仅在精原细胞和早期精母细胞中表达的lncRNA，表明其可能在精子发生的早期阶段发挥作用。NLC1-C在生精功能正常的生精小管中主要位于精原细胞和早期精母细胞的细胞质中，而在生精功能降低的患者中，其主要位于精原细胞和早期精母细胞的细胞核中。NLC1-C过表达促进细胞生长，而其低表达抑制细胞生长并加速细胞凋亡[7]。微阵列分析发现，精子成熟阻滞（maturation arrest，MA）的NOA患者NLC1-C表达显著下调。NLC1-C作为抑制因子通过与细胞核和细胞质中的核仁蛋白结合调节miR-320a和miR-383的表达，NLC1-C是 miR-320a和miR-383在人类精子发生中的直接靶向标记物。然而，当NLC1-C在精原细胞核和睾丸中的初级精母细胞中积累，降低miR-320a和miR-383的表达时，导致男性不育[7]。

生长停滞和DNA损伤诱导基因7（growth arrestand DNA damage-inducible gene 7，gadd7） 是 一 种DNA损伤诱导型lncRNA。研究发现在精索静脉曲张的患者中gadd7表达上调，gadd7的相对表达水平与精子数量呈负相关，过表达gadd7后GC-1和GC-2中细胞增殖受到抑制以及细胞凋亡增加，应激诱导的gadd7可能通过上调促凋亡调节因子Bax和下调抗凋亡调节因子Bcl2使精子生成过程受损导致男性不育[13]。精子特异性阳离子通道蛋白1（Catsper1）仅在雄性生殖细胞中表达，该基因的启动子具有双向转录活性，研究发现其上游启动子反义转录产生一种名为Catsper1au的基因，Catsper1au是一种无内含子和多腺苷酸化的lncRNA。在精子发生过程中表达的大多数基因在生精细胞的不同阶段显示出独特的表达谱，而Catsper1au在精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞以及支持细胞中表达，在成熟精子中未见表达，表明了lncRNA-Catsper1au在精子发生过程中的作用[14]。

2 MiRNAs

2.1 MiRNAs概述及其作用机制 MiRNAs是一类长约22个核苷酸的新型单链小分子RNA，是一类重要的非编码RNA，通过碱基配对的方式与目标mRNA的3′非翻译区（3′-UTR）结合，并引起翻译抑制和（或）mRNA降解来调节转录后基因的表达[15]。MiRNAs在物种中高度保守，并在多种生物过程中发挥关键作用，包括发育、分化、细胞增殖和细胞凋亡。MiRNAs在血浆、血清、精浆和其他体液中高度稳定且丰富。MiRNAs介导的转录后调控已成为精子发生的重要调节因子，雄性生殖细胞中特异性缺失一种核糖核酸内切酶DICER（miRNAs成熟过程中的关键酶类），可导致精母细胞凋亡的增加、染色质的缺陷以及精子细胞核形成的异常[16]。符梅等[17]通过对比NOA患者和生精功能正常患者的DICER基因的多态性及其等位基因，发现DICERrs3742330等位基因AA可能与男性无精症有关。通过miRNAs的微阵列分析、实时荧光定量PCR技术及siRNA序列分析技术，证实大量miRNAs高度且特异性表达于睾丸组织和睾丸内某些特定类型的生殖细胞中[18]。

2.2 MiRNAs与精子发生 Yao等[19]鉴定了梗阻性无精症（OA）及NOA患者3种主要生精细胞（精原细胞、粗线期精子细胞及圆形精子细胞）的miRNAs表达谱，发现在这3种细胞中miRNAs的数量及含量均有差异。RNA深度测序显示，OA患者和NOA患者中396个miRNAs在人精原细胞中差异表达，395个miRNAs在人粗线期精母细胞中差异表达，378个miRNAs在人圆形精子细胞中差异表达；通过生物信息学方法发现几种差异表达的miRNAs：hsa-mir-99b-5p/hsa-mir-99a-5p/hsa-mir-100-5p与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3），hsa-mir-143-3p与SMAD3，hsa-mir-145-5p与刺激蛋白1（SP1），hsalet-7e-5p与TGFBR1，hsa-mir-424-5p与AKT3有结合位点。FGFR3是FGF2的受体，已证明其对SSCs的存活和增殖至关重要。FGFR3的表达仅限于人类睾丸中的A型精原细胞，表明FGF2/FGFR3信号通路可能参与人类精原细胞的自我更新和（或）分化。信号通路蛋白SMAD3属于SMAD超家族成员，其可以激活转化生长因子β（TGF-β），对精子发生有重要作用。SP1调节Sohlh1基因转录，这是早期精子发生过程中精原细胞分化所必需的。转化生长因子β受体1（TGFBR1）存在于大鼠和公猪睾丸的粗线期精母细胞中，但在长型精子细胞中不存在，提示TGFBR1可能参与减数分裂的控制。此外，AKT3是磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶（PI3K-AKT）通路的成员，激活该通路对于维甲酸诱导精原细胞分化的Stra8表达至关重要[19]。

Lian等[20]通过微阵列技术分析NOA患者和正常对照者的睾丸组织miRNAs差异表达谱，发现NOA患者154个miRNAs差异表达下调，19个表达上调。进一步鉴定了NOA患者中几种下调的miRNAs，例如miR-17-92和miR-371，miR-2，miR-3在NOA患者中低表达，而miR-17-92和miR-372/miR-373可下调凋亡基因并可能抑制细胞凋亡；NOA患者这些miRNAs的下调可能会引起细胞凋亡的增加，进而参与NOA的发生。

Marcon等[21]研究发现，miR-188-3p在人睾丸组织的精原细胞和精母细胞中表达丰富，且可在小鼠细胞减数分裂时检测到。另有研究发现miR-188-3p在NOA中显著下调，通过调控其靶基因DNA错配修复蛋白1（MLH1）导致生精细胞凋亡[22]。Xu等[23]验证了miR-188-3p是小鼠睾丸内聚嘧啶束结合蛋白2（PTBP）的靶点，而PTBP2通过与生殖细胞特异性磷酸甘油酸激酶2的3′-UTR区结合，提示miR-188-3p可能是调控PTBP2参与精子发生的另一潜在通路。

NOA患者行显微睾丸取精术（microdissection testicular spermextraction，micro-TESE）时，从取出精子和未取出精子的睾丸组织中鉴定出180种差异表达的miRNAs。未取出精子组中13种miRNAs表达上调，167种miRNAs表达下调，其中有86种miRNAs表达缺失，但在取出精子组中表现出高表达，表明这些miRNAs在精子发生中可能起重要作用，或许可作为判断micro-TESE时能否取出精子的标志物[24]。Wu等[25]发现NOA患者的miR-34b/c和miR-449a在雄性生殖细胞中的表达水平显著降低。MiR-34b/c和miR-449a具有相似的碱基序列，因此其对调节精子发生具有相同的作用。在小鼠中，miR-34b/c和miR-449a的单个敲除对精子发生没有影响；而miR-34b/c和miR-449a的同时失活可导致雄性小鼠不育。

3 LncRNAs与miRNAs的相互作用

3.1 LncRNAs调节miRNAs Salmena等[26]提出竞争性内源性RNA假说，其中包括具有miRNA反应元件（microRNA response elements，MRE）的ceRNA可通过与细胞中的MRE结合来阻断靶miRNAs的功能。作为最重要的细胞内ceRNA之一，lncRNAs可通过与MRE吸附靶miRNAs，并抑制由miRNAs介导的靶向mRNA降解。这也是lncRNAs参与的常见转录后调控机制之一[27]。

LncRNAs在基因表达及信号转导中发挥复杂功能，并且还可以作为前体或支架起作用。因此，作为miRNAs前体，lncRNAs可通过细胞内RNA剪接产生特异性miRNAs并增强靶mRNA的转录后调节[28]。研究表明，RNA polⅡ转录的lncRNA-H19不仅可充当分子海绵调节let-7，还可作为前体通过RNA剪接产生两种成熟的miRNAs，miR-675-5p和miR-675-3p[28-29]。

LncRNAs含有识别元件，其结构、功能与miRNAs类似，通过与miRNAs竞争特异性识别靶向mRNA的3′-UTR，可以抑制miRNAs对靶mRNA的负调节。

3.2 MiRNAs调节lncRNAs LncRNAs在其转录过程中类似于mRNA且具有结构相似性。因此，除了靶向mRNA外，RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中的miRNAs还可以通过不完全碱基互补配对调节靶lncRNAs，并降低其结构和功能稳定性[30]。

MiRNAs还可以通过某些机制增强lncRNAs的表达。研究表明，成熟的细胞质miRNAs可以进入细胞核并调节mRNA和非编码RNA的核转录。例如，脂肪来源的干细胞中的成熟miR-140通过与NEAT1基因的974-998bp和2370-2403bp位点的特异性结合进入细胞核，并显著促进NEAT1的基因表达以及改善其核稳定性[31]。

4 结语

LncRNAs及miRNAs在精子发生的各个阶段都发挥着重要的调控作用。目前对于NOA患者lncRNAs及miRNAs的功能研究尚少，通过对不同生精功能的睾丸组织及参与精子发生各阶段的细胞中差异表达lncRNAs和miRNAs的分析，将有助于深入研究非编码RNA在精子发生中涉及的机制，同时还可以从lncRNAs与miRNAs在NOA中相互调控方面去发现更多新的涉及精子发生的机制。