复发性流产相关精子因素的研究进展

张馨月，王晖，钱云

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指在妊娠20周之前连续发生两次或两次以上妊娠丢失[1]，约影响2%～5%的育龄夫妇[2]。国内学者通常将RSA定义为妊娠28周之前出现三次或三次以上胎儿丢失，约占生育期妇女的1%[3]。根据先前研究报道，曾有过妊娠失败的女性，再次妊娠失败的风险（25%）高于先前成功妊娠的女性（4%）和初孕妇（5%）[4]。RSA患者长期处于焦虑和抑郁状态，同时连续妊娠丢失所带来的经济损失和婚姻家庭关系的恶化，使得RSA成为生殖医学领域临床医生的技术及伦理挑战，亟待解决。目前RSA的危险因素主要包括高龄、生活方式影响的流行病学因素、抗磷脂综合征、与父母及胚胎染色体异常相关的遗传因素、子宫或宫腔结构异常导致的解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫因素、血栓前状态、孕妇的全身性疾病及环境因素等[5]。针对RSA的研究主要集中在女性方面，对有男性因素导致的RSA重视远远不够。近些年来，基于循证医学证据的治疗，如使用阿司匹林和肝素治疗抗磷脂综合征等改善了RSA的妊娠结局，然而，仍有约50%病因不明的病例有待解决[6]。

妊娠建立和维持过程中的关键事件是相互关联的，胚胎质量及其宫内发育微环境决定妊娠结局，而胚胎质量与卵子和精子质量密切相关。近年研究发现，卵子质量对成功活产的贡献为70%～80%，子宫条件所占的权重为10%～15%，剩余的10%～15%为精子的贡献，然而当精子有异常时，男方因素对于可否获得活产后代的影响显著增大[7]。同时，研究表明精子质量与胚胎发育潜能息息相关，而精子质量异常可以通过影响早期胚胎发育导致流产的发生。针对男性因素导致的RSA，临床一般会积极处理病因、改善生活方式、给予复合维生素或抗氧化剂等，并发现可以在相当程度上改善妊娠结局，因此对精子质量异常的评估及相应处理可以为不明原因RSA的诊治提供思路。目前，男性精子质量异常的影响因素主要有精子形态、精子膜完整性以及精子DNA/染色质完整性等，随着研究的不断深入，男性精子质量造成RSA的比例逐渐上升。下面将详述精子因素与RSA的相关性、可能机制及处理措施。

1 精子因素与RSA

1.1 传统精液参数与RSA 精子形态是传统精液参数中的重要组成部分，作为男性生育力评估的基本检查，能够较好地反映精液质量和生育潜能。Zidi-Jrah等[8]对照研究了22例RSA患者男性伴侣与20例具有正常精液参数的可育男性，结果显示RSA男性伴侣精子形态异常率（74.8%）高于可育男性对照（54.2%），精子形态与RSA存在相关性。与此相似，Gil-Villa等[9]的研究显示，与正常可育男性相比，RSA患者男性伴侣有较低的精子正常形态率（P＜0.001）。然而，对于精子形态与RSA之间的关系仍然存在争议，也有部分研究如Eisenberg等[10]对344例单胎妊娠的女性进行观察性前瞻性研究后发现，其男性伴侣的精子形态与RSA的风险关系不大。基于这些争议，最近一项纳入15篇文献的Meta分析表明，与可育男性对照组相比，RSA组男性精子形态正常百分率降低，作者认为造成研究结果差异的原因也许是多方面的，包括纳入研究对象标准、研究方法、样本量大小等[11]。目前对畸形精子的判定在染色技术、分类标准等方面存在一定的局限性，需要进一步证据来更好地阐明精子形态与不明原因RSA之间的关系。精子形态异常导致RSA的可能机制错综复杂，精子运动能力取决于精子形态，精子正常形态率与精子的受精能力呈正相关，只有正常精子达到一定的比例时才能保证正常的精子活力[12]。且形态正常的精子所占百分比对妊娠时间有影响，精子形态正常率低可能缩短妊娠时间，出现早期流产。尽管精子选择时滤过了大部分活力差和畸形的精子，但是仍有异常精子到达受精地点的可能[7]，形成低质量的胚胎。有假说指出，RSA是“低质量”胚胎植入失败导致的，是一种自然选择机制，精子形态改变可能导致精子质量低下，从而产生低质量胚胎，影响其早期发育[13]。此外，另一个可能的原因是，异常精子是导致活性氧簇（ROS）过度产生的原因之一，ROS水平增加可能会导致精子功能障碍，从而影响其受精能力，导致胚胎早期发育异常，形成流产[14]。

1.2 抗氧化治疗 有研究认为，氧化应激可能在精子形态异常导致RSA中发挥了重要的作用，一项纳入16项随机对照试验的Meta分析表明，抗氧化剂的使用可以增加妊娠率，其纳入的16项研究中，10项研究（63%）显示，与安慰剂相比，抗氧化剂改善精子活力，12项研究中的2项（17%）改善精子形态[15]。近期的一项研究显示，给亚生育力的男性补充抗氧化剂，可以增加活产率[16]。因此，在临床上，可以建议有RSA史的男性伴侣口服抗氧化剂（维生素C和E、锌、硒、叶酸、肉碱和类胡萝卜素等），可改善精子质量，在一定程度上减少流产的发生。同时可以考虑通过精子密度梯度离心去除大部分异常精子后行人工授精，但具体疗效还需要更多试验来证实。

2 精子功能测试与RSA

2.1 精子膜完整性与RSA 在精子功能测试中，与RSA相关的研究主要涉及低渗肿胀试验。低渗肿胀试验用来评估精子膜完整性。1997年Buckett等[17]首次对20例RSA患者男性伴侣与20例未知生育力的男性进行低渗肿胀试验评分，发现2组尽管精液常规参数无差异，但是RSA组低渗肿胀试验评分明显低于对照组。近期的一项对74例RSA患者的男性伴侣与65例可育男性对照的研究也发现，RSA组低渗肿胀试验评分低于可育对照组，表明形态正常的精子在膜功能上可能存在细微缺陷[18]。目前仍需要更多有合理设计的研究来验证RSA与精子膜完整性之间的关系。随着胞浆内单精子注射（ICSI）的开展，低渗肿胀试验功能测试不再成为男性不育的常规检查方法，但通过这些功能检测可以揭示精子存在的缺陷，有助于临床医生的决策，提供指导方案。同时，低渗肿胀试验由于方法简单，价格低廉，适合在医疗资源匮乏的地区评估精子功能。精子膜是精子最外层的界膜，直接受各种物质刺激，精子膜完整性是精子受精的前提，当精子膜出现缺陷时，精子尾部不出现卷曲，影响精子的能量代谢、受精、顶体反

应和精卵结合。而精子膜完整性导致RSA的可能机制是精子质膜损伤影响DNA完整性，从而影响受精过程，有缺陷的精子与卵子结合形成受精卵后，可能导致受精卵没有足够的生长潜能，使胚胎在植入前发育迟缓，诱导植入部位的能力降低，或者较慢的胚胎发育与子宫环境之间失去同步化，导致早期胚胎发育停滞引起流产[19]。还有研究推测，胚胎植入缺陷不是由与卵母细胞结合的某个精子决定的，而是与附在精子膜上的毒性因子有关，毒性因子在精子与卵子结合过程中又被转移到透明带，继而转移到胚胎[20]。有缺陷的精子可通过释放氧自由基等有毒的代谢物改变透明带的理化性质，从而损伤卵母细胞或原核胚，导致流产。

2.2 顶体反应与RSA 顶体位于精子头部质膜与核膜之间，对顶体的检测包括结构与功能检测，完全缺失顶体的圆头精子可被严格的精子形态评估发现，只有顶体结构完整和顶体反应正常的精子才能结合到卵子透明带上[21]。顶体反应测试用于测定顶体功能，顶体反应与RSA的相关研究不多，有研究将低渗肿胀试验、顶体状态作为功能参数研究了RSA患者配偶的精子功能，发现RSA组中45.7%存在顶体功能缺陷，42.9%低渗肿胀试验结果异常，低活力的精子与功能异常相关，但活力正常的精液仍有31.4%存在功能缺陷，形态检查仅能预测5.7%的RSA[22]。因此，顶体功能异常可以检测精子结构的细微损伤，这是导致精子诱导活胚胎能力降低的原因，从而引起流产，其导致RSA的机制与形态异常导致RSA的机制类似。

2.3 临床处理 在临床上，针对精子膜完整性受损的精子可以考虑用糜蛋白酶处理精子以及人工授精，当蛋白酶无法获得时，可以尝试其他方法。精子细胞膜上的毒性因子在低温下是不稳定的，实验室人员可以通过精子冷冻和解冻过程去除那些含有毒性因子的精子[23]。同时在辅助生殖技术（ART）领域，ICSI时可以先通过低渗肿胀试验去除膜受损的精子，改善妊娠结局，如Charehjooy等[24]的一项随机对照试验显示，在ICSI中应用低渗肿胀试验使胚胎具有更高的发育潜力和植入率，以及更高的妊娠率，为低渗肿胀试验评分低的RSA患者的治疗提供了方向。

3 精子DNA/染色质完整性与RSA

3.1 DNA碎片指数（DFI）与RSA 临床上用DFI显示DNA的完整性。近年来胚胎学家越来越认可DNA损伤（高DFI值）对胚胎发育的影响。关于精子DNA完整性与RSA之间的关系，Bareh等[25]研究了26例RSA患者男性伴侣与31例具有正常精液参数的可育对照的精子DFI，研究中仅选取精子浓度＞20×106/mL，前向运动力≥50%以及正常形态率≥30%的精液样本进行分析，结果显示，即使RSA组与对照组精液参数正常，RSA组的精子DFI高于对照组，表明精子DFI在RSA中发挥了重要作用。最近的一项对意大利人群的研究表明，112例RSA组患者配偶精子DNA完整性受损，DFI显著高于114例精液参数质量高的可育男性对照，且数值与114例精液参数受损的不育男性对照相似，同时研究还发现精子DFI与RSA男性患者的年龄及女性配偶的流产次数呈正相关[26]。一项Meta分析也指出，精子DFI增加将导致妊娠率降低，流产率增加[27]。精子DFI升高可能通过阻碍受精、早期胚胎发育、植入和妊娠而影响生育力。含有DNA损伤的精子可在一定程度上回避精子竞争中的优胜劣汰，从而将生殖缺陷遗传给后代，导致胚胎发育不良、先天性畸形和早期自然流产。对精子DNA损伤的评估应该推荐给RSA患者男性伴侣。

3.2 DFI对于RSA的预测 Kumar等[28]通过受试者工作特征曲线对45例RSA患者进行深入研究，结果显示DFI约26%的男性虽然能使女方怀孕，但无法维持妊娠，因而导致RSA，同时DFI＞30%导致胚胎质量严重下降。与此相反，Bellver等[29]通过精子染色质分散试验发现尽管RSA患者配偶精子DFI明显高于可育男性，但受试者工作特征曲线表明该指标不能预测RSA。虽然精子DFI高水平尚不能被认为是发生RSA风险的预测因素，但是大多数研究认为两者间存在相关性，用精子DFI增加预测RSA发生还需临床工作者严格统一测量方法，纳入更多人群进行深入研究。

3.3 胚胎和卵母细胞对于DNA损伤的修复与RSA一项小鼠实验表明，尽管胚胎具有一定的DNA损伤修复能力，但如果在受精时由较高DFI的精子形成的受精卵，超过了胚胎自身的修复能力，可能会使胚胎存在遗传不稳定，导致畸形或流产的发生，且精子介导的跨代基因组不稳定性取决于DNA损伤的程度[30]。同时，卵母细胞具有良好的修复精子DNA损伤的能力，可以通过直接逆转损伤，单链损伤修复，碱基切除修复，核苷酸切除修复，错配修复等不同途径修复精子DNA损伤，但是这种修复是有阈值的，并且精子DNA损伤的积累会抑制核苷酸切除修复机制，因此持续的精子DNA损伤导致不育或流产[31]。一些研究从引起DNA损伤的可能机制来探讨精子DNA损伤导致RSA的原因。Makhlouf等[32]认为，如果精子DNA损伤的断链未被修复，精浆中的物质就会进一步使精子DNA的蛋白编码区基因受到破坏，造成不同程度的精子功能缺陷，影响胚胎质量，从而导致流产。

3.4 染色质结构与RSA 在正常精子发生过程中，大多数核组蛋白是由鱼精蛋白1和鱼精蛋白2以1∶1的比例取代的，与染色质结构异常相关，Rogenhofer等[33]对25例RSA患者配偶精液样本和32例正常精液参数对照样本分析后发现，RSA组鱼精蛋白1和鱼精蛋白2 mRNA的水平异常，且二者比值异常，受精前精子基因受到核蛋白的保护，精子核携带的父方遗传基因必须在受精后才开始表达，当核蛋白不成熟时，精子基因不能被有效保护，则精子遗传基因不稳定，导致胚胎发育异常，造成夭折或流产。Talebi等[34]研究认为，鱼精蛋白缺乏和凋亡使精子在父系基因组启动后，有可能将受损害的基因组带入卵中，影响胚胎发育，导致RSA。

3.5 临床处理 对氧化应激高水平导致的精子DNA/染色质完整性受损可采取适当的抗氧化治疗，抗氧化剂是ROS的清除剂，因此建议精子DNA/染色质完整性受损的RSA男性伴侣短期内口服抗氧化剂来逆转高ROS浓度对精子质量的不利影响[35]。也有文献报道对于DFI及精子脂质过氧化水平高的RSA男性患者给予抗氧化剂、富含抗氧化成分的饮食3个月及以上后，9对RSA夫妇中有7对成功妊娠，而对照组8对夫妇中仅3对成功妊娠[36]。最近的一项研究显示，膳食中添加DHA能够改善精子的抗氧化能力和降低精子DNA损伤[37]。也有研究从基因层面探讨了DNA修复基因X射线修复交叉互补基因组1（XRCC1）和DNA连接酶4（LIG4）多态性与DNA损伤相关[38]，临床上针对这类患者可以考虑行基因多态性检测以明确病因，提供遗传咨询。

4 研究展望

RSA严重影响育龄夫妇的生活质量，目前对于男性精子因素所致RSA的研究仍处于探索阶段，没有明确的绝对病因，但男性提供了胚胎一半的基因组，精子质量在胚胎早期发育中起着至关重要的作用，临床上对于RSA患者的男性伴侣评估不容忽视，病因学筛查如传统精液分析、精子功能测定以及DNA完整性检测应该被普遍采取，综合各项检查结果评估精子质量。

近年来，组学技术迅猛发展，从DNA和基因到代谢物来研究精子质量，蛋白质组学提供有关精子蛋白功能的信息，能够识别精子质量，代谢组学从分子水平提供更加敏感的精子质量生物标志物。目前已证实精子的非整倍体率升高，表观遗传物质改变可以导致RSA，基因测序技术的发展能够从基因层面明确流产的遗传学因素，ART中的胚胎移植前基因诊断可以解决精子遗传物质异常导致的RSA。未来，随着科技的发展和技术的进步，对男性精子质量与RSA相关性的研究不断开展和深入，可能会出现一些新的检测方法、机制理论和治疗措施，例如研究表明，在体外受精中，精子端粒长度与胚胎质量呈正相关[39]，但是需要更多的试验来证实精子端粒长度与RSA的关系，为RSA的治疗带来新突破。