温肾丸对肾阳虚生精障碍大鼠治疗作用的药效学研究

黄小庆 徐云森 吴江平 严文兵 高荣芳 郭宇明 招活 苏劲松

(广州市中医医院泌尿外科，广东 广州 510130)

睾丸生精功能障碍是导致男性不育的主要原因，临床表现为少精、弱精甚至无精。西医对不育症的治疗一般采用对因对症治疗，如激素替代治疗、抗生素治疗、精索静脉曲张及隐睾症的手术治疗等；此外，辅助生殖技术是近年来治疗不育症的热点，尤其是卵细胞内精子注射(intracytoplasmic spermatozoo injection，ICSI)被认为是男子不育症治疗上的一次革命[1]，但是，其诊疗费用高，使绝大多数不育患者难以承担。中医学对男性不育的认识已有两千多年的历史，在治疗上具有独到之处，疗效较好，患者易于接受。因此，探求中医药治疗，从体内改善精子质量，使一部分患者通过简单经济而恰当的方法解决生育问题不失为一有效途径。本研究采用我院临床应用多年、主治男性不育症的有效经验方—温肾丸，拟通过动物实验的研究方法，探讨其对肾阳虚生精障碍大鼠治疗作用的药效学机制，为挖掘和发挥中医药治疗优势病种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验动物为SD大鼠(成年雄性，SPF级别，体质量180～210 g)，购于南方医科大学[许可证号：SCXK(粤)20160041]，大鼠饲养及实验均在清洁级动物实验室内进行。药物与试剂：温肾丸为浓缩水丸，由广州市中医医院制剂室提供(生产批号：粤药制字Z06022722)；克罗米芬(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号1325021)；腺嘌呤(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号E1814057)； 抑制素B(INHB)、睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为： Y9DTQ7USGC，GGCIBVX15T，PKTV3QZEH2，7DU612VNTK)。仪器：生物组织智能脱水机(湖北安立信医疗实业有限公司，ART-12B)；显微镜(OLYMPUS CORPORATION，CKX41SF)；切片机[莱卡显微系统(上海)有限公司，RM2016]；生物组织摊烤片机(湖北安立信医疗实业有限公司，ATK-7)；生物组织石蜡包埋机(湖北安立信医疗实业有限公司，ABM-6L)；离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司，JW3021H)；酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司，AMR-100)。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模及给药 60只SD雄性大鼠适应喂养1周，随机分为空白对照组10只；单纯模型组10只；阳性对照组(克罗米芬组)10只；温肾丸低、中、高剂量组各10只。除空白对照组外 ，其余各组动物按腺嘌呤200 mg/(k g·d)体质量灌胃10 d制备肾阳虚模型。造模结束后开始给药，实验组动物按低、中、高剂量组分别给予温肾丸混悬液50 mg(kg·d)、100 mg(k g·d)、200 mg/(k g·d)体质量灌胃，连续30 d；阳性对照组用克罗米芬混悬液13.5 mg/(kg·d)体质量灌胃，连续30 d。所有动物均予标准饲料喂养，自由饮水。空白对照组和单纯模型组灌服等容量生理盐水，其他条件相同。实验期间仔细观察并记录各组大鼠的表现，如精神体态、毛色情况、活动反应、进食、饮水与大便情况等。大鼠每周称重1次，以调整给药剂量。

1.2.2 标本采集及指标检测 各组大鼠于末次给药1 h后，采用异氟烷进行麻醉，用眼眶采血法收集血液2～3 mL于抗凝管中，将其编号，静置1 h后，抽取血液放入离心管中离心，转速为3 000 rpm，5 min，留取血清按说明书进行操作检测血清T、FSH、LH、INHB含量，酶标仪检测460 nm的OD值。同时获取双侧睾丸，将睾丸样本置于固定液中固定10～12 h。固定后的样本经常规梯度酒精(80%、90%、100%)脱水，二甲苯I(无水乙醇∶二甲苯=1∶1 )浸泡2h后二甲苯Ⅱ和Ⅲ分别处理10 min、5 min进行透明。将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块。连续切成厚度5 μm的薄片，每隔30张取蜡带放到加热的水中烫平，分别贴于涂有蛋白甘油(用于HE染色)的载玻片上，置于45 ℃恒温箱中烘干备用。石蜡切片HE染色进行病理组织学观察及Johnson评分。

2 结 果

2.1 各组一般情况观察 空白组，发育较快，对外界刺激反应灵敏、活动正常，毛发光滑泽润。模型组大鼠喜暖怕冷、倦缩拱背、毛无光泽且散乱、精神萎靡、反应迟钝，形体消瘦，生长缓慢。温肾丸各剂量组和克罗米芬组造模10 d后开始干预，随着实验的进行，与单纯模型组比较上述症状逐渐减轻，给药30 d后，温肾丸组一般状态改善较为明显。除模型组大鼠死亡2只外，其余各组均无死亡。

2.2 睾丸组织病理观察及 Johnsen评分 各组病理活检显示，空白组(图A)大鼠生精小管基膜完整，轮廓清晰，生精细胞层次丰富，管腔处有大量精子细胞，间质细胞分布均匀；模型组(图B)大鼠生精小管基膜塌陷，变性，生精细胞层次模糊不清，排列稀疏，大量细胞脱落与细胞碎片拥堵管腔，管腔内精子细胞缺失，间质细胞聚集成团；克罗米芬组(图C)大鼠生精小管基膜欠完整，生精细胞层次模糊不清晰，管腔生精细胞稀疏，间质细胞聚集分布；温肾丸低剂量组(图D)大鼠生精小管基膜欠完整，生精细胞排列稀疏，管腔内精子数量较少，间质细胞聚集分布；温肾丸中、高剂量组(图E、图F)大鼠生精小管基膜较完整，轮廓较清晰，生精细胞层次较多，管腔内精子细胞较多，间质细胞散在分布。各组大鼠睾丸活检Johnson 评分比较见表1。

A：空白组；B模型组；C克罗米芬组；D温肾丸低剂量组；E温肾丸中剂量组；F温肾丸高剂量组

图1 各组大鼠高倍镜下生精小管形态

表1 各组大鼠睾丸活检Johnson 评分比较

注：与模型组相比，*P<0.01，与温肾丸低剂量组、克罗米芬对照组相比，△P<0.01。

2.3 各组大鼠血清T、FSH、LH、INHB含量比较 模型组各项相关指标均有变化，其中T和INHB减少，FSH、LH升高，与其他组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。温肾丸各剂量组和克罗米芬组治疗后大鼠血清T、INHB上升，FSH、LH降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；其中温肾丸高、中剂量组与低剂量组和克罗米芬组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清T、FSH、LH、INHB比较含量

注：与模型组相比，*P<0.01，与温肾丸低剂量组、克罗米芬组相比，△P<0.01。

3 讨 论

男性不育症中医统属 “精少无子”、“精清”、“精冷”等范畴，中医认为肾藏精主生长发育与生殖，本病主要责之于肾，若肾阳虚损，温煦生化功能失职，或肾阴不足，精气化生乏源以及虚火内灼津液，可导致精少清冷，精弱无力而造成不育。虽然不育症的病因病机变化多端，治疗方法多种多样，但“补肾”仍是中医药治疗男性不育的重要方法。

肾阳虚所致的男性不育在中医男科的研究中一直是备受重视的课题。肾阳虚作为中医学的概念，是指肾阳为一身阳气之根本，它对体内各个脏腑起着温煦生化的作用，若肾阳虚损，温煦功能失职，则可导致虚寒衰弱诸症及生殖机能的减退。

肾阳虚模型的制作方法较多，有糖皮质激素注射法、腺嘌呤灌喂法、 锁阳水灌注法等。糖皮质激素造模是应用较广泛的造模方法，该模型主要通过影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能，导致动物对外界环境变化的应激适应能力下降，动物的生命活动减弱、畏寒喜暖等表现与肾阳虚的表现一致[2]，但此法对性腺轴的影响不明显。纵观国内外文献，有关研究睾丸性不育动物的模型实验有多种，就实际操作方面而言，以腺嘌呤模型的效果最为理想。高浓度的腺嘌呤代谢产物可以直接毒害肾脏和睾丸的生殖细胞、间质细胞，镜检肾组织呈萎缩倾向，结缔组织增生，睾丸组织萎缩，大部分生精小管退行性变化，精子产生减少或缺损等病理改变可作为肾阳虚证的客观指标[3-4]。有研究报道，从“肾主生殖”角度评价腺嘌呤与氢化可的松诱导的肾阳虚模型，认为腺嘌呤诱导的肾阳虚证SD大鼠模型在形态学与性腺指标方面更符合中医肾阳虚形态学表现[5]。本研究造模结果证实，模型大鼠从腺嘌呤灌喂开始逐渐出现喜暖怕冷、倦缩拱背、毛无光泽散乱、精神萎靡、反应迟钝，形体消瘦，生长缓慢等“肾阳虚”表现；模型大鼠睾丸病理组织学观察所见，大鼠生精小管受损明显。实验结果显示，温肾丸干预后可改善造模大鼠的肾阳虚证现象，有效缓解大鼠睾丸生精小管和生精细胞的损伤，提高生精障碍大鼠睾丸病理组织Johnson评分。

性激素FSH、LH、T的变化与生精功能状态有着密切的关系，睾丸的支持细胞与生精细胞共同构成睾丸的曲细精管，为精子发生提供独特的微环境。睾丸生精功能主要受下丘脑—垂体—睾丸轴调控，下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)作用于脑垂体，使其合成和分泌卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)。精子发生是FSH作用于支持细胞与LH通过刺激间质细胞分泌睾酮(T)相互协同作用的结果[6-7]。以往的实验研究已证实，肾阳虚证存在着下丘脑—垂体—性腺轴不同环节、不同程度的功能紊乱；补肾中药能够通过减轻性腺激素细胞超微结构的损伤，改善下丘脑—垂体—性腺轴的功能而治疗不育[8-12]。本研究结果显示，温肾丸干预后大鼠血清T水平上升，FSH下降，表明温肾丸能够调节模型大鼠的性激素水平，使受损的生精功能得到不同程度改善。此外， FSH在生精过程中除直接启动精原细胞的分裂和早期生精细胞发育外，还促使支持细胞分泌抑制素B(inhibinB，INHB)，INHB被认为是反映支持细胞功能的血清标记物，其能够选择性地抑制脑垂体合成和分泌FSH，还可以阻断下丘脑刺激引起的垂体FSH释放，对FSH的分泌发挥着极强的负反馈调节作用[13]。相关研究报道，当睾丸生精功能受损时，血清 INHB 水平下降；INHB血清水平与精子密度、精子总数呈显著正相关，与血清FSH呈显著负相关[14]。Pierik等[15]应用睾丸活检评分(Johnsen评分)评价FSH、INHB对精子发生正常或障碍的准确性，认为INHB的相关系数较FSH的相关系数有统计学意义。在本研究中，温肾丸中、高剂量组大鼠血清 INHB水平均高于模型对照组和阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，结果与上述文献报道相符。

本研究结果表明，通过温肾丸治疗后模型大鼠肾阳虚症状得到明显改善，而且能有效调节紊乱的性激素水平及上调INHB水平；睾丸病理观察及Johnsen评分提示受损的大鼠睾丸生精功能得到较好的缓解和修复，从而为温肾丸在临床治疗肾阳虚型男性不育提供可靠的实验依据。