艽龙胶囊及其主成分对溃疡性结肠炎小鼠的作用

郭伦锋 刘尹 郭军 李瑶 刘铁明 袁鹰 董明芝 谢艳华 王四旺△

(1.安康市中心医院药剂科，陕西 安康 725000；2.空军军医大学口腔医院B超室，陕西 西安 710032；3.西北大学药学院，陕西 西安 710069；4.西安正大制药有限公司，陕西 西安 710043)

艽龙胶囊是由秦艽单味中药材提取物制备而成的胶囊剂，其内容物为黄色至棕色的颗粒，味苦、微涩；具有清肝泄热的功效，适用于功能性消化不良属肝胃郁热证者，症见胃脘饱胀、脘部烧灼、口干口苦等病证。本课题组前期研究中，标定了艽龙胶囊HPLC指纹图谱的23个共有峰，相识度为0.966～0.982，并测定了10批制剂中马钱苷酸、龙胆苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、山栀苷甲酯、獐芽菜苷、异荭草苷、异牡荆黄素的含量。我们发现艽龙胶囊中龙胆苦苷含量最高(占比达65%以上)，其次为马钱苷酸(约占15.0%)，再次为6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(约占6.5%)。由此结果可以看出，艽龙胶囊系多化学成分复方制剂，其在体内发挥作用可能具有多靶点效应。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)系临床消化科常见、难治性疾病，至今其发病原因尚不明确。由于大肠粘膜慢性炎症和溃疡性病变，临床主要表现出腹痛、腹泻、里急后重和粘液脓血便等症状。虽然UC不是危及生命的疾病，但严重影响着人们的身体健康和生活质量，对家庭和社会医疗保障等造成沉重负担，至今UC尚无专科特效治疗药物。龙胆苦苷具有抗炎镇痛、清除自由基和治疗胰腺炎等药理作用[3-4]。王海波等证实龙胆苦苷对热和化学刺激引起的疼痛反应有明显的镇痛作用，对急、慢性炎症反应均有一定的抑制作用。张丽等报道龙胆苦苷可明显减轻脂多糖致急性肺损伤小鼠肺组织炎症反应程度，具有较好的抗急性肺损伤作用。基于艽龙胶囊含有65%以上龙胆苦苷，亦未见其对UC预防或治疗作用的研究报道，本文探讨了艽龙胶囊及其主成分对UC小鼠保护作用，为寻求有效治疗UC的药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 动物为SPF级C57/BL6小鼠80只，6～8周龄，体质量18～22 g，雄性，由空军军医大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(军)2012-0007。动物在独立换气笼盒(IVC系统)饲养，温度22～26 ℃，湿度50%～70%，12 h光照/黑暗周期循环，适应性饲养一周后用于实验。所需饲料和舒克贝塔SPF级精选刨花垫料购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司。药物为艽龙胶囊(西安正大制药有限公司提供，批号20170216K)，龙胆苦苷(纯度98%，批号201703112，上海纯优生物科技有限公司)，马钱苷酸(纯度98%，批号201701201，上海纯优生物科技有限公司)，6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(纯度98%，批号201802093，上海纯优生物科技有限公司)，巴柳氮钠(湖北百科亨迪药业有限公司，批号170801)，美沙拉嗪(上海爱的发制药有限公司，批号170422)。试剂与仪器为葡聚糖硫酸钠(美国MP，批号Q8758)，惠安易特敏E-termine FOB粪便隐血检测试剂盒(深圳惠安生物科技有限公司，批号20180111)，NO检测分析试剂盒(艾美捷科技有限公司，批号K262-200)，小鼠血管活性肠肽ELISA酶联免疫试剂盒(上海谷研实业有限公司，批号20171223)，小鼠P 物质酶联免疫分析试剂盒(上海研生实业有限公司，批号20180117)，TNF-α小鼠ELISA检测试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司，批号HL20044)。Modle型酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，5418R低温高速离心机(德国Eppendorf公司)，ME235S型电子分析天平(德国赛多利斯公司)。

1.2 方法 (1)分组与模型制备：将C57/BL6小鼠随机分为8组，分别为正常对照组、模型组、艽龙胶囊组(62 mg/kg)、龙胆苦苷组(40 mg/kg)、马钱苷酸组(9 mg/kg)、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(4 mg/kg) 组、巴柳氮钠组(500 mg/kg)及美沙拉嗪组(900 mg/kg)。采用自由饮用2.5%DSS建立UC小鼠模型，实验开始后除正常组外，其余组小鼠饮用水均用3%DSS水溶液代替，供小鼠自由饮用(DSS水溶液每天新鲜配置)，造模周期7 d。(2)给药方法：造模开始同时给予治疗药物，即从第1天开始各组灌胃相应剂量治疗药物，正常组和模型组给予等容量生理盐水。艽龙胶囊和阳性药物巴柳氮钠及美沙拉嗪给药剂量均根据临床用量换算(小鼠给药剂量=人每天用量/70 kg体质量×9.1)，龙胆苦苷、马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷剂量均根据我们测得其艽龙胶囊中的含量确定。(3)检测指标与方法：①疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分。DAI评分是用于判断UC的一个重要指标，以小鼠体质量下降程度、大便性状及血便情况进行综合评分，评价UC小鼠的发病程度。评分标准为0分：体质量下降0%，大便正常，无隐血；1分：体质量下降1%～5%，大便松散，隐血阳性；2分：体质量下降6%～10%，大便松散，轻微肉眼可见血便；3分：体质量下降11%～15%，稀便，明显肉眼可见血便。第7天对所有小鼠进行DAI评分。②结肠粘膜损伤指数(colonmucosa damage index，CMDI)评分。第7天给药结束后，禁食不禁水12h，眼底静脉丛采血后，分离自肛门2 cm处向上8 cm的结肠，沿肠系膜纵向剖开肠腔，记录粪便形状及便血发生情况，用生理盐水洗净，吸去水分，称重；肠粘膜朝上平铺于玻璃板上，使用放大镜眼观，按文献标准实施CMDI评价，动物结肠大体形态无损伤评为0分；结肠粘膜轻度充血，水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡评为1分；结肠粘膜充血水肿，粘膜粗糙呈颗粒状，有糜烂或肠粘连评为2分；结肠高度充血水肿，粘膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径小于1.0 cm，肠壁增厚或表面有坏死及炎症评为3分；结肠在3分基础上溃疡最大纵径大于1.0 cm 或全肠壁坏死评为4分；同时记录结肠的溃疡数及其溃疡面积。③结肠组织病理学分析。取出10%多聚甲醛固定后的结肠，纵向切取0.2 mm，包埋并切取3～5 μm的蜡片，用hematoxylin-eosin staining(H&E)染色，在200倍显微镜下观察组织病理改变情况，并进行炎症评分。组织病理学损伤依据之前报道[9-10]进行blinded fashion评分。即：炎症细胞浸润程度(0分：无；1分：粘膜层炎细胞浸润；2分：粘膜层及粘膜下层炎细胞浸润；3分：炎细胞浸润至肌层)；隐窝破坏(0分：无；1分：基底1/3隐窝被破坏；2分：基底2/3隐窝被破坏；3分：全部隐窝被破坏)；病变范围(0分：<1%；1分：1%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)。④血清及结肠组织中相关指标检测。采血后，室温静置3 h，3 500 rpm离心15 min，分离上层血清，按照试剂盒要求检测血清中NO含量和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结肠组织肉眼观察结束后，分离一部分，称重，单面刀片切碎转入组织匀浆器，加1 mL pH7.4 PBS液，匀浆，3500 rpm低温离心，上清液在-20 ℃保存，按照检测试剂盒说明检测血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和小鼠P物质(substance P，SP)含量。

2 结 果

2.1 DAI和CMDI评分 造模第7天，正常组小鼠活动自如，被毛光泽，饮食规律，大便呈颗粒状，便隐血阴性，体质量呈明显增加趋势，结肠粘膜眼观完整、光滑，皱襞和纹理清晰，无充血、水肿、溃疡，肠管厚度均匀；模型组小鼠体质量明显下降，外观可见精神疲倦，活动减少，毛色无光泽，出现严重血便和粘液便，结肠粘膜肉眼见糜烂或坏死，程度不等的肠扩张、肠缩短，肠管增厚、充血、水肿、散在溃疡和出血及肠粘连，艽龙胶囊、龙胆苦苷、马钱苷酸及阳性药物组体质量下降不明显，精神状态、被毛色泽、活动程度等均明显好于模型组动物，结肠粘膜肉眼所见组织形态及腹泻和隐血病症等明显见减轻；6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷组与模型组比较，症状有所减轻，但体质量仍呈下降趋势，且出现明显血便。见图1。

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与模型组比较#P<0.01。

图1 各试药对UC小鼠的DAI评分及CMDI评分

2.2 各试药对UC小鼠组织病理学影响 H&E染色结果表明，正常组小鼠结肠镜下形态完整，腺体排列整齐，无炎性细胞浸润；模型组镜下可见大量炎性细胞浸润并累及全层，杯状细胞消失，黏膜损坏严重，大部分隐窝损坏；艽龙胶囊、龙胆苦苷、马钱苷酸及阳性药物组细胞排列较整齐，组织形态正常，隐窝形态完整，仅有少量炎性细胞浸润；6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷组黏膜下层仍有较多炎性细胞浸润，但隐窝损坏程度减小，细胞排列较整齐，炎症程度有所减轻。见图2。

图2 各试药对UC小鼠结肠组织病理学影响

2.3 各试药对UC小鼠血清中NO及TNF-α的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清中NO和TNF-α含量显著升高；与模型组相比，艽龙胶囊、龙胆苦苷、马钱苷酸及各阳性药物组血清中NO及TNF-α含量显著降低；与模型组相比，6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷组血清中NO含量与模型组相比无显著性差异，TNF-α含量与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、图4。

与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与模型组比较#P<0.01。

图3 各试药对UC小鼠血清中NO及TNF-α含量的影响

注：与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与模型组比较#P<0.01。

图4 各试药对UC小鼠结肠中VIP及SP的影响

2.4 各试药对UC小鼠结肠中VIP及SP的影响 与正常组小鼠相比，模型组小鼠结肠中VIP和SP含量显著升高；与模型组相比，艽龙胶囊、龙胆苦苷、马钱苷酸及各阳性药物组结肠中VIP和SP含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)，而6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷组小鼠结肠中VIP和SP含量与模型组无显著性差异。

3 讨 论

UC的病因至今尚不明确，不少学者认为UC的发病与基因因素、自身免疫和外源物质诱发宿主反应密切相关。血性腹泻是UC早期最常见的病症，继而可出现腹痛、频繁血便、体质量下降、里急后重、呕吐或伴发高热等症状，个别病人还可伴发关节炎、虹膜睫状体炎、肝功能障碍和皮肤病变等。基于Jiang的研究[11]，我国目前UC发病率已增长至0.45/万。近十余年来，UC的治疗虽已取得明显进展，但其药物治疗主要还是在控制环境、免疫、遗传和肠道微生态的相互作用的基础上才具有明显疗效，并非药物的直接治疗作用[12]。

本研究采用成人日用剂量的艽龙胶囊及其主成分占比换算剂量灌胃给予UC小鼠一周，结果显示艽龙胶囊及其主成分龙胆苦苷和马钱苷酸能够显著改善UC小鼠DAI和CMDI评分，显著降低UC小鼠血清NO和TNF-α含量，同时还能降低结肠组织SP和VIP含量。由此说明，(1)艽龙胶囊作为主治功能性消化不良的药物对UC的发生具有显著的预防作用；(2)艽龙胶囊预防UC的功效成分主要是龙胆苦苷和马钱苷酸；(3)鉴于龙胆苦苷和马钱苷酸的总体疗效低于艽龙胶囊(无统计学差异)，但其趋势亦表明艽龙胶囊系多成分的复方发挥着协同作用；(4)基于上述实验结果，我们推测艽龙胶囊对UC可能也具有很好的治疗作用，但有待下一步研究阐明。