皮肤替代物及其有效性评价的研究进展

王涵，薛彬，史建峰，韩倩倩，王春仁中国食品药品检定研究院，北京市，102629

0 引言

皮肤是人体面积最大的器官，具有复杂的多层结构，是抵御外部刺激的第一道防线。皮肤非常容易受到创伤、烧伤、炎症等因素的损害，而皮肤创伤修复、尤其是慢性创伤修复的过程及其潜在的病理生理学变化是非常复杂的，如何进行皮肤快速而可靠的再生也一直是人们关注的热点。

皮肤替代物可起到对创面临时性封闭、保护创面，阻挡异物和病原体入侵，防止组织液丢失的作用，同时一些皮肤替代物中还含有生物活性物质，可促进机体创面周围的细胞增殖，加速创面愈合。目前的皮肤替代物种类较多，组织工程皮肤及新型的皮肤替代物发展迅速，在其应用于临床前选择恰当方法对其有效性进行合理评价是必要的。

1 皮肤替代物的发展概况

1.1 传统皮肤替代物

传统皮肤替代物在伤口愈合过程中起到暂时性屏障作用，主要包括同种人工合成膜、同种异体皮、异种皮等几大类。人工合成膜主要是由生物材料制成的各种薄膜、涂膜、喷雾膜等，常用材料有胶原、聚乳酸、透明质酸、海藻酸盐等；同种异体皮常来源于遗体捐献者的皮肤，也可用小儿包皮环切所弃皮肤，是仅次于自体皮的暂时性皮肤替代物；异种皮多为猪来源，制备过程复杂，有一定的免疫原性，且与同种异体皮一样在使用过程中均存在传播疾病的风险[1]。

1.2 组织工程皮肤

目前公认的组织工程皮肤是指由种子细胞和支架材料体外三维构建培养成的皮肤替代物，但广义上还包括仅由细胞或仅由支架组成的组织工程化皮肤产品。现今临床上用于移植的组织工程皮肤主要分为3类：真皮替代物、表皮替代物和全皮替代物，市场上针对这3类都已有成熟的产品出现。如Dermagraft,TransCyte等真皮替代物；Epicel等表皮替代物；Apligraf 等全皮替代物。中国对组织工程皮肤的研究，近年来也已取得了一定成果。安体肤作为国内首例组织工程皮肤，已顺利实现产业化。组织工程皮肤不仅是一种活性敷料，且由于包含细胞、天然细胞外基质、生长因子等生物活性物质，可促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生，缩短愈合时间。

1.3 创面愈合治疗的新方法

1.3.1 理想皮肤替代物的要求

目前应用的传统皮肤替代物或组织工程皮肤，仅含有表皮、真皮两个层次或之一，不包含正常皮肤的毛囊、血管、汗腺以及黑色素细胞等皮下组织结构。因此移植的皮肤愈合较慢，耗时较长，有移植失败的风险。同时，含细胞的组织工程皮肤产品保质期短，生产和运输成本较高，产品型号较单一，也并非最理想的皮肤替代物。

理想的皮肤替代物应该有如下特征：能抵抗感染；能防止皮肤脱水；能抵抗牵拉力和伤口缺氧；价格合理；制备、使用及储存方便；适用范围广且储存时间长；无免疫原性；有灵活的厚度；能与不规则伤口紧贴；能长期贴合于愈合时间较长的创面；能长时间覆盖于创口表面；能再造表皮、真皮及附属器官[2]。

1.3.2 新技术在皮肤替代物中的应用

新的生物材料、干细胞及3D打印技术的发展促进了皮肤替代物的发展。干细胞可通过释放生长因子、细胞外基质、蛋白酶等来参与创面修复，提高创面修复的质量；组织诱导材料、干细胞及3D打印技术的结合是3D打印皮肤的研究热点[3-6]。利用NIKS细胞进行增殖制备而成的StrataGraft已被美国FDA认定为再生医学先进疗法领域的首个产品，在临床上也被证明有较好的疗效[7-9]。

2 皮肤替代物的有效性评价

2.1 体外试验

在进行体内试验前对皮肤替代物进行体外试验研究可以帮助我们理解伤口愈合的机制及伤口愈合中的级联反应。体外试验可针对产品的具体用途进行设计，相对经济、快速。

细胞划痕试验、Transwell细胞迁移试验、体外成血管试验等均是目前比较常用的体外试验，可定量评价体外创伤愈合。3D器官模型，如3D表皮模型、3D全层皮肤模型更能准确反映受试物作用于人体后的功效，实现多维数据的检测，目前也已经有多种商业化的3D皮肤模型出现，为相关的研究提供了便利。在进行体外试验过程中结合相关生物标记物（如IL-1，IL-6，MMPs等）的识别及测定，对评价创面愈合的效果也有重要的意义。通过计算机模型结合组织再生过程中涉及的生物化学和生物物理过程也可对支架和组织替代物的设计进行指导。体外试验模型尽管可提供关于皮肤的一部分或者多组成部分的相关信息，但是未必与体内试验的结果相关，伤口愈合研究的理想模型不仅要模拟人体皮肤伤口类型的结构，而且要模拟细胞和分子间的相互作用[11-13]。

2.2 体内试验

由于人创面标本在临床上取材受限制，在对皮肤替代物创面修复的有效性进行临床前研究时常需建立实验动物模型。

2.2.1 动物种属的选择

杜洛克猪是公认的研究人皮肤病理及创伤愈合的理想动物模型，它与人的表皮结构、神经密度、基质厚度和其它生物学指标相似。但作为动物模型来说成本较高，且很多分子生物学试剂对猪也是不适用的，用其进行科学研究工作相对来说难度较大。

鼠相对来说是更具有可行性的模型[14]。但需注意的是，虽然人和鼠的皮肤都由表皮层、真皮层及皮下组织三层构成，但是每层的解剖学及生理学均有差异。同时，鼠具有广泛的薄肌肉层（只在人的颈阔肌中发现），能使伤口在创伤后迅速收缩，伤口收缩的程度与人皮肤间存在较大的差异。另外，以鼠为试验动物时也需考虑不同性别鼠皮肤的解剖及生理差异。

斑马鱼、非洲爪蟾、蝾螈等作为研究皮肤创面愈合的新型动物，其创面是以无瘢痕方式愈合的，也在近年来用于创面修复的研究[15]。

2.2.2 研究创面修复有效性的常用模型

目前常用于皮肤替代物有效性研究的模型主要分三类：急性伤口愈合模型，包括切开性伤口模型、切除性伤口模型、烧烫伤模型等；慢性创伤模型、包括感染伤口模型、局部缺血性伤口模型、糖尿病溃疡模型等；病理性瘢痕模型，包括裸鼠瘢痕移植模型、兔耳增生性瘢痕模型等。其中切开性急性创口模型因为构建所需要的材料和技术简单、可重复性强，目前最常用[16-19]。

将人皮肤移植到裸鼠背部，在生物环境下进行人皮肤移植物的研究也是体内研究皮肤创伤愈合的方法之一。当然，人体创伤修复过程中必要的炎症及免疫反应在免疫缺陷小鼠体内必然减弱，这些因素也会限制用其得到的结果与人的相关性。

2.2.3 有效性评价指标的选择

创伤愈合可通过大体和组织学联合观察，生物化学和生物机械学测量，创伤愈合标志物的分析，常将细胞学反应和免疫学反应结合来分析创伤修复的过程[20-21]。常用指标有创面愈合率、创面愈合时间及组织组织病理学分析等。创面愈合率可对创面进行拍照后应用Image J等图像分析软件对愈合面积进行测定；创面愈合时间是创面完全上皮化所需要的时间，而上皮化依靠肉眼观察；用组织学病理学方法评价创面愈合客观有效的指标，对生物组织切片进行HE染色后可通过显微镜观察上皮再生和分布情况，也可对表皮结构、表皮-真皮邻接处和微水疱、胶原束和皮肤结构、表皮再生和粒细胞浸润数量进行半定量打分。

3 相关标准

皮肤替代物多与创伤组织、血液循环接触，按照《医疗器械分类规则》多属于II类或III类医疗器械。医疗器械行业标准YY/T 1570—2017 《组织工程医疗器械产品皮肤替代品（物）的术语和分类》中也给出了皮肤替代物的术语、分类和命名。

在进行皮肤替代物有效性评价之前，要保证其安全性。皮肤替代物需无有刺激性和致敏性，无免疫原性，对预期用于慢性溃疡的皮肤替代物来说还需保证其无致癌性；预期用于生育妇女的需要进行生殖发育毒性；对所有非生物降解的材料也需进行遗传毒性研究。具体需进行的安全性评价试验方法可参照医疗器械国家标准GB/T 16886系列。

针对皮肤替代物的有效性评价， FDA的指导原则Guidence for Industry Chronic Cutaneous Ulcer and Burn Wounds-deνeloping Products for Treatment和医疗器械行业标准YY/T 1477.1—2016《接触性创面敷料性能评价用标准试验模型 第1部分：评价抗菌活性的体外创面模型》，YY/T 1477.2—2016《接触性创面敷料性能评价用标准试验模型 第2部分：评价促创面愈合性能的动物烫伤模型》，YY/T 1477.3—2016《接触性创面敷料性能评价用标准试验模型 第3部分：评价液体控制性能的体外创面模型》，YY/T 1477.4—2017《接触性创面敷料性能评价用标准试验模型 第4部分：评价创面敷料潜在粘连性的体外模型》等也为我们合理进行皮肤替代物的有效性评价提供了依据。