老鸦瓣叶中黄酮成份的提取及初步鉴定

余晓雪，苏 畅，周龙飞，史劲松

(江南大学药学院，江苏 无锡 214122)

老鸦瓣(Tulipaedulis( Miq.) Baker)为百合科(Liliaceae)郁金香属(Tulipa)植物，目前主要来源为野生，广泛分布于安徽、河南、江苏、山东等地，春、秋、冬季均可采收[1]。中药光慈菇为其去掉膜质皮和绒毛后的干燥鳞茎，晒干或鲜用，其味甘、辛，性寒，有小毒，具有清热解毒、散结消肿的功效，主治咽喉肿痛、瘰疬结核、瘀滞疼痛、痈疖肿毒、蛇虫咬伤等[2]。近年来研究发现，光慈菇对于乳腺癌的治疗具有显著的效果，临床也有用于辅助治疗咽喉癌、淋巴瘤的报道[3]。由于使用领域不断扩大而适生环境日益减少等多种原因，自然野生药材供求矛盾较为突出[4]。

为缓解野生药材供应问题、促进中药资源的合理利用，近年来，国内外许多学者陆续对中药非药用部位进行了更加深入的药化、药理和临床应用的探索[5]。老鸦瓣在每年的农历初春之际开始长出嫩叶，一般为双片，江苏、安徽等地俗称其为双芽头、双芽子，芽叶凌霜而生，因而又有“霜芽”之称。我国部分地方有采摘食用老鸦瓣嫩叶的习惯。目前在安徽亳州、蒙城等市县，老鸦瓣有一定规模的人工栽培，但以获取花、叶为主。花叶作为老鸦瓣的非药用部位，目前相关研究还不深入，需要明确花叶是否存在特定的药用成分，或进行功能食品开发的价值。

黄酮类化合物是一类广泛分布在植物中天然活性产物，具有极为广泛的生理活性作用，如抗氧化、抗衰老、清除自由基、降血脂、降血压、治疗心脑血管疾病、抗炎、抗菌、抗癌、镇痛、提高免疫、对消化性溃疡的保护作用等药用保健功能，其次在食品，化妆品等行业中具有很高的利用价值。本研究对老鸦瓣嫩叶进行了干燥，初步进行成分分析后，发现其存在较多的黄酮成分，进而研究了黄酮的超声波辅助提取，并通过条件优化得到了最佳提取工艺，为老鸦瓣生物质资源的合理利用和栽培产业的发展提供帮助。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

UV-2100紫外分光光度计(尤尼可上海仪器有限公司)；MS104S电子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-800KDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Himac CR22G台式高速冷冻离心机(日本日立公司)等。

1.2 试剂与样品

芦丁对照品购自国药集团化学试剂有限公司(批号20181011)；乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等均为分析纯；水为蒸馏水。

样品由蒙城县南望槐种植专业合作社提供，经对其DNA中ITS2序列测定，鉴定为老鸦瓣(Tulipaedulis)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

新鲜老鸦瓣清洗后80℃漂洗30 s，真空干燥箱60℃将其烘干至水分<5%，再用实验型粉碎机将干燥样品粉碎成末，备用(图1)。

1.3.2 老鸦瓣中黄酮物质的提取及条件优化

取老鸦瓣叶粉末约2 g，精密称定后至三角瓶中，加入一定体积、体积分数浓度的乙醇溶液，在一定功率下进行超声波辅助提取。提取结束后，取上清液5 ml，加无水乙醇稀释至10 ml，离心后取上清0.5 ml，用去离子水定容至2.0 ml作为样品，按后续总黄酮测定方法进行测定，并计算黄酮提取率。按照上述基本实验方法，研究超声波不同设定功率、乙醇不同体积浓度、料液比、提取时间对黄酮提取率的影响。

正交试验优化：根据单因素试验，对超声功率、料液比、超声时间、乙醇体积分数做L9(33)正交试验(见表1)。

表1 正交试验因素和水平表Table1 Orthogonal test factors and levels

1.3.3 黄酮含量的测定

标准品溶液制备：精密称取芦丁标准品14 mg，加60%乙醇加热溶解并定容至50 ml。

芦丁标准曲线的建立：精密移取芦丁标准品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0 ml置具塞比色管中，用去离子水定容至2.0 ml，加入5%亚硝酸钠溶液0.5 ml，摇匀，室温下放置6 min，加入0.5 ml 10%硝酸铝溶液，室温下放置6 min，加入2 ml 1 mol/L NaOH混匀。室温下放置15 min，在波长为500 nm的条件下测定吸光度。

黄酮含量的测定：测定提取物在500 nm下的吸光度值，带入标准曲线的回归线方程，计算提取物黄酮总含量。

1.3.4 老鸦瓣中黄酮物质的HPLC初步鉴定

称取老鸦瓣叶黄酮粗提物粉末50 mg于250 mL三口烧瓶中，加入20 mL甲醇，摇匀，加入20 mL质量分数为25%的HCl溶液，氮气保护，90℃加热回流1 h，冷却至室温后用甲醇洗涤并转移至50 mL容量瓶中，摇匀，用甲醇定容至刻度，即得老鸦瓣叶黄酮粗提物供试品水解反应后的样品溶液。以该样品液进行HPLC检测，计算得老鸦瓣叶黄酮中不同种类黄酮的含量。

2 结果与分析

图1为新鲜的老鸦瓣叶，长度约为12-15 cm，含水率在92%以上，其新鲜芽叶在4℃冰箱可以存储一周，因此需要进行及时处理。老鸦瓣叶清洗后采用80℃热水进行漂洗30 s，然后真空烘干，粉碎后可得到青色细粉(图1)。

2.1 芦丁标准曲线绘制

为测定老鸦瓣叶芽中黄酮含量，以芦丁为标准品，首先进行芦丁标准曲线的测定和绘制(图2)，由图中曲线可以回归得到芦丁浓度X(mg/ml)和吸光度Y的关系曲线y=0.3576x-0.0014，其R2=0.9994，说明芦丁浓度和吸光度呈良好线性关系。

图1 新采摘的老鸦瓣叶及其干燥粉碎后的样品Fig.1 Freshly picked corvid leaves and dried crushed samples

图2 芦丁标准曲线图Fig.2 Standard curve of rutin

2.2 超声时间对提取率的影响

在超声功率为80 W的条件下，分别提取30、45、60、75 min，以此研究超声时间对提取率的影响。结果表明，随着超声提取时间增大，老鸦瓣叶粉末中总黄酮的提取率逐步增大，在60 min处获得最高提取率，而后开始下降，因此适宜的超声时间为60 min。

图3 超声时间对提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate

2.3 乙醇浓度对提取率的影响

按照基本提取工艺方案，保持其他条件不变，分别以体积分数为50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液进行黄酮提取，研究乙醇浓度对提取率的影响。由图4可以看出，随着乙醇体积分数的提高，老鸦瓣芽叶中黄酮可达到6%以上的提取率，但当乙醇浓度大于80%时，提取率随之快速下降。推测主要原因为高浓度乙醇的脂溶性上升，极性下降，而黄酮作为多羟基化合物，需要提取溶剂保持一定的极性。同时，高浓度乙醇的提取液色素溶出增多，对总黄酮的检测结果有一定的干扰，因此乙醇体积分数应以60%为宜。

图4 乙醇浓度对提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield

2.4 料液比对提取率的影响

以上述优化的参数为基础，即乙醇体积分数60%、提取功率80 W、提取时间为60 min的条件下，考察料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50对黄酮提取率的影响(图5)，图中显示，总黄酮提取率随着料液比的增大先快速增大，但在1∶30之后不再进一步增大，提取率呈现下降趋势。过高的料液比并不能增加黄酮成分的有效提取，而且会造成后续处理的工作量。因此，料液比可以控制在1∶30。

2.5 超声功率对提取率的影响

进一步考察超声功率为60、70、80、90、100 W对提取率的影响。由图6可知，80 W时黄酮的提取率最高，之后迅速下降，推测可能是超声波对部分黄酮类化合物结构造成破坏，或者是促进了黄酮类物质与其他物质的反应。因此选择超声功率为80 W最优。

图5 料液比对提取率的影响Fig.5 Effect of material - liquid ratio on extraction rate

图6 超声功率对提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on extraction rate

2.6 超声提取老鸦瓣叶总黄酮的正交结果

根据单因素试验，对超声功率、料液比、超声时间、乙醇体积分数做L9(33)正交试验，正交结果见表二。由结果分析可知，不同因素对总黄酮提取效果的影响顺序为A>C>B，即乙醇体积分数>提出时间>料液比，老鸦瓣叶最佳提取条件为A2B2C3,即60%乙醇溶液，料液比1∶30，提取时间为60 min，此条件下，黄酮的提取率可以达到6%以上。

2.7 HPLC初步鉴定老鸦瓣中黄酮类物质

选择儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素六种黄酮作为对照品，通过HPLC法测定六种黄酮在208nm处的峰面积，计算其含量。分析表明，老鸦瓣黄酮中至少含有芦丁、杨梅素、山奈酚等黄酮成分，其中芦丁含量最高，为35.6 mg/L，其他几种成分含量低，还需要进一步确认。

表2 正交试验结果

图7 混标HPLC测定图Fig.7 HPLC diagram of mixed standard

图8 样品的HPLC测定图Fig.8 HPLC diagram of the sample

标准品浓度(mg/L)儿茶素0.89芦丁35.6杨梅素2.35槲皮素0.87山奈酚4.63异鼠李素0.69

2 结论与讨论

老鸦瓣叶芽中含有6%以上的粗黄酮，具有较高的利用价值。本文研究了老鸦瓣叶

中总黄酮的提取条件，比较了乙醇体积分数、料液比、提取时间、超声功率4个因素对总黄酮提取率的影响，确定最佳提取工艺为60%乙醇溶液、料液比为1∶30，超声功率为80 W，提取60 min；经HPLC初步鉴定，老鸦瓣黄酮类物质主要包括芦丁、杨梅素、山奈酚等种类，可为老鸦瓣叶的生物制资源合理应用提供依据。