金花茶叶中山奈酚的提取工艺优化及HPLC法测定

何守峰，段鹏飞，倪 穗

(宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

金花茶(Camellianitidissima)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿阔叶小高位芽植物[1]，热带常绿灌木至小乔木，是我国特有的植物，是世界著名的珍稀植物，资源极为珍贵，被誉为“植物界大熊猫”、“茶族皇后”金花茶叶中含有的多种黄酮类、多酚类化合物能够预防和治疗心脑血管疾病、肿瘤癌症疾病，具有降低血糖、抗氧化、抗肿瘤以及增加自身免疫能力等药理作用。山奈酚属于黄酮类化合物，具有抗肿瘤作用，且毒副作用小，能提高正常皮肤的抗氧化能力，抑制皮肤损伤和肿瘤发生[2～8]。曾有实验研究表明[9]，金花茶叶中含有与山奈酚类结构相似的物质为山奈素，为此通过实验研究证明，未发现叶中含有山奈素。本篇以金花茶中山奈酚为研究对象，拟通过提取方法优化，同时考察定量测定的线性范围，以及实验的稳定性、重复性、快速性等，对不同种类的金花茶叶中山奈酚进行定量测定。旨在进一步探索高效液相色谱法测定山奈酚的质量分数的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料与试剂

原料：防城港普通金花茶(C.nitidissimaChi)、崇左金花茶(C.chuongtsoensisS．Y．LiangetL．D．Huang)、凹脉金花茶(C.impressinervisChangetS.Y.Liang)、中东金花茶(C.euphlebiaMerr.exSealy)、毛瓣金花茶(C.PubipetalaWanetHuang)的成熟叶片，于2018年5月采自广西省东兴市源之源生态公司苗圃。在阴天上午采摘无病虫害完整的金花茶成熟叶片，放入自封袋中封口后带回实验室，冷冻干燥，于-40℃冰箱保存。

试剂：盐酸、磷酸、甲醇，均为分析纯；山奈酚、山奈素标准品：北京索莱宝有限公司。

1.2 仪器

仪器：L仪器:Agilent1100型高效液相色谱仪;G1314A型紫外检测器;G1310A型高压泵(美国安捷伦科技有限公司);BT224S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);单道微量可调移液枪(芬兰ThermoFinnpipette)；0.45 μm微孔滤膜。

1.3 主要方法

茶叶样品经过采摘、冷冻干燥、粉碎、浸提、加热回流提取处理，然后进行金花茶叶中山奈酚含量的测定。实验对提取温度、提取时间、甲醇-0.4%磷酸比例3个因素进行单因素和正交试验，优化提取工艺条件。

1.2.1 供试品溶液制备

取金花茶样品粉末(过2号筛)约1.0 g，精密称定，精密加入甲醇-0.4%磷酸酸混合溶液，称定重量，加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得对照品溶液。

1.2.2 对照品溶液制备

取山奈酚对照品约10mg精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1 mL 含山奈酚0.4 mg 作为山奈素对照品储备液。精密吸取0.2 mL山奈酚对照品储备液，置5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1 mL含山奈酚0.008μg的山奈酚对照品溶液。

1.2.3 线性关系考察

取山奈酚对照品分别制成浓度梯度系列的对照品品溶液，进样，记录山奈酚峰面积值。以对照品峰面积(Y)为纵坐标，以进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，计算其线性回归方程。

1.2.4 提取温度对提取效果的影响

选择甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4，提取时间为100 min，提取温度分别为70℃、80℃、90℃、100℃、110℃，考察提取温度对提取效果的影响。

1.2.5 提取时间对提取效果的影响

选择甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4，提取温度为80℃，提取时间为80 min、90 min、100 min、110 min、120 min，考察提取时间对提取率的影响。

1.2.6 甲醇-0.4%磷酸比例对提取率的影响

选择提取温度为80℃，提取时间为100 min，甲醇-0.4%磷酸比例分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6,考察甲醇-0.4%磷酸比例对提取率的影响。

1.2.7 山奈酚提取的正交试验

根据单因素的试验结果设计正交因素水平表(见表1)，每个因素取3个水平，选用L9(33)正交表进行正交试验，优化金花茶叶中山奈酚提取条件。

表1 正交试验因素水平

1.2.8 高效液相测定山奈酚含量

色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇为流动相；流动相：水，检测波长360 nm；流速0.8 m L/min。进样量10 μL；理论板数按没食子酸峰计不低于4000。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

以对照品峰面积(Y)为纵坐标，以进样量(X)为横坐表，绘制标准曲线，计算其线性回归方程为Y=4 000 000X+27 076(r=0.999 3)。在范围内0.00304 mg/m L～0.00608 mg/m L，对照品溶液进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 蒸馏加热提取山奈酚的单因素实验

2.2.1 提取温度对提取率的影响

如图1所示，当提取温度为70℃-100℃时，山奈酚提取率先增大再降低，当温度为100℃时，提取率降低。当温度为80℃时，提取率最高。

2.2.2 提取时间对提取率的影响

如图2所示，当提取时间为100 min时，山奈酚的提取率最高，故选择100 min为山奈酚的最佳提取时间。

2.2.3 甲醇-0.4%磷酸比例对提取率的影响

如图3所示在甲醇-0.4%磷酸比例逐渐变大的过程，山奈酚的提取率在甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4时最高，总体来看，相比加热温度和加热时间，甲醇磷酸比例对提取率影响相对较小。

图1 加热温度对提取率的影响Fig 1 Effect of heating temperature on extraction rate

图2 加热时间对提取率的影响Fig 2 Effect of heating time on extraction rate

图3 甲醇-0.4%磷酸比例对提取率的影响Fig 3 Effect of methand -0.4% phosphoric acid ratio on extraction rate

2.3 正交试验

由表2可以看出，以山奈酚提取率为指标，3个影响因素对提取率的影响大小依次为B、A、C，即加热提取的时间影响最大，其次是加热时间和甲醇-0.4%磷酸比例。选取最优组合为A2B2C2，即提取温度为90℃，提取时间为100 min，甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4。

表2 金花茶叶微波杀青工艺试验与极差分析

2.4 优化工艺的验证试验

采用优化提取条件：蒸馏提取温度为80℃，加热时间为100 min，甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4进行三次平行试验，实验结果见表2得到山奈酚平均提取率为46%，RSD=93 %，表明该提取方法重现性好，能够达到最佳提取效果。

2.5 高效液相色谱法测定山奈酚

准确称取山奈酚标准品，用甲醇溶解后定容25 mL 作为标准储备液，移取1 mL通过0.45 μm 微孔滤膜。重复取三次进样，每次进样10 μL ，山奈酚出峰时间及光谱图如图所示。

2.6 金花茶高效液相色谱图

取5种金花茶叶样品，按照1.2.1供试品液制备方法制备供试品溶液，提取条件为蒸馏提取温度为80℃，加热时间为100 min，甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4，按照进样条件。得到防城港普通金花茶、崇左金花茶、凹脉金花茶、中东金花茶、毛瓣金花茶5种金花茶色谱图。

2.7 不同品种金花茶叶山奈酚含量测定

取5种金花茶叶样品，每批两份，精密称定，按照1.2.1供试品溶液制备供试品溶液。精密吸取供试液10，按照色谱条件测定，5种样品的测定结果见(表3)，本方法重复性好，可作为金花茶茶叶中山奈酚的定量方法。

图4 山奈酚标准品色图谱Fig 4 Kaempferol standard chromatogram

图5 A 防城港普通金花茶、B 崇左金花茶、C 凹脉金花茶、D 中东金花茶、E 毛瓣金花茶高效液相图谱Fig 5 Liquid chromatogram of C. nitidissima Chi (A),C. chuongtsoensis S.Y. Liang et L. D. Huang (B), C. impressinervis Changet S. Y. Liang (C), C. euphlebia Merr. ex Sealy (D), C. Pubipetala Wan et Huang

表3 不同品种金花茶山奈酚含量测定

3 结论

本次实验前，我们对金花茶叶中山奈素含量进行了测定，但是根据高效液相色谱中出峰时间以及保留时间来看，各个样品中并未发现山奈素的存在，根据对山奈素分子量及色谱图的分析，我们发现金花茶叶中存在一种与山奈素相差一个甲基的山奈酚。在样品提取中，我们考察了水浴回流、加热回流两种方法，结果显示以加热回流提取温度为80℃，加热时间为100 min，甲醇-0.4%磷酸比例为1∶4。采用高效液相色谱法测得的最佳提取率为46%。通过对不同物种的金花茶中山奈酚含量测定，我们测得凹脉金花茶中山奈酚为1.8 mg/g，与建立了高效液相色谱法测定金花茶叶中山奈酚含量的测定方法。该方法结果准确，重复性良好，对金花茶成分研究具有实际意义，对进一步研究金花茶成分提供了研究基础。