SOX1过表达通过β-catenin通路抑制胃癌细胞增殖和侵袭①

胡爱萍 吴贵恺 吴艳杰 郑荣娟 周 蕾

(唐山市工人医院消化内科，唐山063000)

胃癌是临床常见恶性肿瘤之一，具有较高的并发率与死亡率且患者预后较差，研究显示影响胃癌治疗效果的主要原因为胃癌细胞增殖及迁移[1]。目前关于胃癌细胞增殖及迁移的机制研究较多，但临床胃癌患者治疗效果仍高居不下，因而进一步分析胃癌发生、发展机制对临床治疗具有重要指导意义。以往研究表明信号通路紊乱、癌基因及抑癌基因表达水平的变化均可导致胃癌的发生及发展[2]。Wnt/β-catenin信号通路可诱导上皮细胞发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，细胞核中β-catenin表达升高可促进肿瘤细胞发生EMT及转移，研究表明Wnt/β-catenin信号通路可促进胃癌细胞增殖及迁移[3]。相关研究表明性别决定区Y框蛋白1(Sex determining region Y-box 1，SOX1)是高迁移率族蛋白(HMG)DNA结构域转录因子家族成员，其可在胚胎发育等过程中发挥重要作用，同时还可参与肿瘤发生及发展过程[4]。研究显示SOX1可直接抑制β-catenin表达并抑制Wnt/β-catenin信号通路进而抑制肿瘤发生，但其具体作用机制有待深究[5]。关于SOX1与胃癌的相关研究相对较少，因此本研究通过上调SOX1表达，观察其对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响以及对β-catenin信号通路的调控作用，以期为胃癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人正常胃黏膜上皮细胞GES-1与胃癌细胞系SGC-7901细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2主要试剂与仪器 RPMI1640培养基、胎牛血清、CCK-8检测试剂盒均购自美国ThermoFisher公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；MTT、RIPA裂解液、PVDF膜、Matrigel基质胶均购自北京索莱宝科技有限公司；Wnt/β-catenin通路激活剂SKL2001购自美国Sigma公司；β-catenin抗体购自美国Santa Cruz公司；上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP-9)抗体均购自上海酶联生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔、兔抗羊IgG购自美国Santa Cruz公司；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；miRNA提取试剂盒、RT-PCR检测试剂盒购自南京vazyme生物公司；Transwell小室购自美国Corning公司；CFX96PCR仪、蛋白凝胶成像仪购自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 取出保存GES-1细胞、SGC-7901细胞，常温条件下复苏，加入含10%胎牛血清的RPMI1640进行培养，加入链霉素(100 μg/ml)、青霉素(100 U/ml)，置于培养箱中培养(温度37℃、5%CO2)，待细胞生长至90%时进行传代培养，稳定2～3代后，收集对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞转染与分组 取对数期SGC-7901细胞，胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，接种于6孔培养板(1×105个/孔)，培养至细胞融合达80%左右，更换为不含胎牛血清的新鲜RPMI1640培养基，严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书操作，将SOX1阴性对照质粒、SOX1 mimis质粒分别转染至SGC-7901细胞，分别命名为阴性转染组、SOX1过表达组，未经处理的细胞命名为空白对照组。β-catenin激活剂组：SOX1 mimis转染SGC-7901细胞前30 min，向培养基加入Wnt/β-catenin通路激活剂SKL2001(终浓度为10 μmol/L)进行预处理。联合组：SOX1 mimis转染SGC-7901细胞后，加入Wnt/β-catenin通路激活剂SKL2001。转染后将其置于培养箱中(37℃、5%CO2)培养6 h，更换含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养48 h，收集细胞上清待测。

1.2.3实时定量PCR(qRT-PCR)检测SOX1及β-catenin mRNA表达 Trizol法提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录，将RNA反转录为cDNA。参照qRT-PCR试剂盒进行RT-PCR反应。反应体系为20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反应程序：95℃ 5 min，95℃ 305 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共循环35次。均以磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GADPH)为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算SOX1、β-catenin mRNA相对表达水平。

1.2.4CCK-8法检测SGC-7901细胞增殖 收集各组SGC-7901细胞并接种96孔，5 000个/孔，分别培养0、12、24、36、48、60、72 h，参照CCK-8检测试剂盒说明书进行实验，分别检测450 nm波长时各孔细胞光密度(OD)，并计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=(空白组吸光度-实验组吸光度)/空白组吸光度×100%。

1.2.5平板细胞克隆实验检测SGC-7901细胞增殖 收集各组SGC-7901细胞，胰蛋白酶消化并制备单细胞悬液，接种于RPMI1640(6 ml)培养皿，1 000 个/皿，混匀，放置在CO2培养箱中培养，观察细胞生长情况(间隔12 h/次)。肉眼观察细胞克隆形成时，取出培养皿，统计克隆形成细胞数量，克隆形成率=(克隆形成细胞数量/1 000)×100%。

1.2.6Transwell法检测SGC-7901细胞迁移和侵袭 细胞迁移实验：收集各组SGC-7901细胞制备单细胞悬液，Transwell小室置于24孔板，将单细胞悬浮液接种于小室上层(10 000个/孔)，小室下层加入含10%胎牛血清RPMI1640培养基(700 μl)，CO2培养箱孵育24 h，清洗风干后采用95%乙醇固定，0.5%结晶紫染色15 min，去除小室滤膜上层未迁移细胞，统计迁移至滤膜下层细胞数量。细胞侵袭实验：将Matrigel胶(50 μl 2.0 mg/ml)加入小室上层底部，后续步骤同细胞迁移实验。

1.2.7蛋白免疫印迹法(Western blot，WB)检测β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表达情况 收集转染后各组SGC-7901细胞，蛋白裂解液反应30 min，采用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，采用8%～10% SDS-聚丙烯(PAGE)胶分离不同分子量的蛋白质。蛋白样品与Loading buffer 1∶4 混匀后上样，电泳结束后，蛋白凝胶移至PVDF膜，转膜反应(4℃)，转膜时间为90 min，结束后采用TBST溶液清洗，5%脱脂牛奶封闭90 min，加入一抗，4℃过夜，次日加入二抗，室温下孵育90 min，加入ECL显色，将其置于凝胶成像仪中观察蛋白表达情况，以目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值表示目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1GES-1、SGC-7901细胞中SOX1表达水平比较 胃癌细胞SGC-7901中SOX1表达水平显著低于正常细胞GES-1(P<0.01)，详见表1。

2.2各组转染效果检测 转染后，SOX1过表达组SOX1表达水平显著高于空白对照组、阴性转染组(P<0.01)，而β-catenin表达水平显著降低(P<0.01)；与联合组相比，SOX1过表达组SOX1表达水平显著升高(P<0.01)，而β-catenin表达水平显著降低(P<0.01)；β-catenin激活剂组SOX1表达水平显著低于联合组(P<0.01)，而β-catenin表达水平显著升高(P<0.01)，详见图1、2。

GroupsnSOX1Normal group61.00±0.18Gastric cancer group60.53±0.09t-5.721P-0.000

2.3SOX1过表达抑制SGC-7901细胞增殖 随着培养时间的延长，SOX1过表达组SGC-7901细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01)，且不同时间点细胞增殖抑制率均显著高于空白对照组、阴性转染组(P<0.01)；与联合组相比，SOX1过表达组SGC-7901细胞增殖抑制率显著增加(P<0.01)，而β-catenin激活剂组SGC-7901细胞增殖抑制率显著降低(P<0.01)，详见图3。

图1 转染后各组SOX1 mRNA表达水平Fig.1 SOX1 mRNA expression levels in each group after transfectionNote: *.P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；#.P<0.01 compared with the Joint group.

图2 转染后各组β-catenin mRNA表达水平Fig.2 Expression levels of β-catenin mRNA in each group after transfectionNote: *.P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；#.P<0.01 compared with the Joint group.

2.4平板克隆形成情况 SOX1过表达组SGC-7901细胞平板克隆形成率显著低于空白对照组、阴性转染组(P<0.01)；与联合组比较，SOX1过表达组SGC-7901细胞平板克隆形成率显著降低(P<0.01)，而β-catenin激活剂组SGC-7901细胞平板克隆形成率升高(P<0.01)，详见表2。

2.5细胞迁移及侵袭情况 SOX1过表达组SGC-7901细胞迁移及侵袭数量均显著低于空白对照组、阴性转染组、联合组(P<0.01)；β-catenin激活剂组SGC-7901细胞迁移及侵袭数量均显著高于联合组(P<0.01)，详见图4、表3。

2.6细胞中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表达情况 SOX1过表达组SGC-7901细胞中β-catenin、N-cadherin、MMP-9蛋白表达量均显著低于空白对照组、阴性转染组、联合组(P<0.01)，而E-cadherin蛋白表达量显著升高(P<0.01)；β-catenin激活剂组SGC-7901细胞β-catenin、N-cadherin、MMP-9蛋白表达量均显著高于联合组(P<0.01)，而E-cadherin蛋白表达量显著降低(P<0.01)，详见图5、表4。

图3 SOX1过表达对SGC-7901细胞增殖的影响Fig.3 Effect of SOX1 overexpression on proliferation of SGC-7901 cellsNote: *.P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；#.P<0.01 compared with the Joint group.

表2 SOX1过表达对SGC-7901细胞平板克隆形成率的影响

Tab.2 Effect of SOX1 overexpression on formation rate of SGC-7901 cell plate clone

GroupsnClonal formation rate(%)Blank control group655.32±9.22Negative transfection group656.47±9.41SOX1 overexpression group6 35.19±5.871)2)β-catenin activator group6 77.38±12.892)Joint group652.18±8.70F-15.056P-0.000

Note：1)P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；2)P<0.01 compared with the Joint group.

图4 SOX1过表达对SGC-7901细胞迁移及侵袭能力的影响(×100)Fig.4 Effect of SOX1 overexpression on migration and invasion of SGC-7901 cells (×100)

表3 细胞迁移及侵袭数量比较

Tab.3 Comparison of cell migration and invasion

GroupsnNumber ofmigrated cellsNumber ofinvading cellsBlank control group6132.15±22.03112.47±18.75Negative transfection group6128.46±21.41120.36±20.06SOX1 overexpression group685.19±14.201)2)83.65±13.941)2)β-catenin activator group6213.15±35.532)215.16±35.862)Joint group6136.49±22.75145.37±24.23F-21.94126.294P-0.0000.000

Note：1)P<0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group；2)P<0.01 compared with the Joint group.

图5 细胞中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表达Fig.5 Expression of β-catenin,E-cadherin,N-cadherin and MMP-9 proteins in cellsNote: 1.Blank control group；2.Negative transfection group；3.SOX1 overexpression group；4.β-catenin activator group；5.Joint group.

Groupsnβ-cateninE-cadherinN-cadherinMMP-9Blank control group61.23±0.210.68±0.111.34±0.221.51±0.25Negative transfection group61.26±0.220.67±0.121.41±0.241.49±0.25SOX1 overexpression group60.52±0.091)2)2.56±0.431)2)0.58±0.121)2)0.55±0.151)2)β-catenin activator group62.35±0.392)0.63±0.112)2.47±0.422)2.69±0.522)Joint group61.38±0.231.58±0.271.64±0.271.58±0.26F-42.02372.55437.32535.603P-0.0000.0000.0000.000

Note：1)P< 0.01 compared with the blank control group and the negative transfection group; 2)P<0.01 compared with the Joint group.

3 讨论

胃癌患者术后生存时间较短，其主要原因为癌细胞增殖、迁移及侵袭[6]。因此，鉴定胃癌细胞转移相关的生物学分子，并探究其分子作用机制对胃癌靶向治疗具有重要意义SOX家族成员可参与肿瘤发生及发展，其中SOX1可发挥抑癌作用[7]。相关研究表明微小RNA-155-5p可通过抑制SOX1表达进而促进乳腺癌细胞迁移及侵袭[8]。肺癌细胞中SOX1表达降低并上调ECT2表达，同时SOX1还可通过影响相关通路表达进而抑制癌细胞增殖及迁移[9,10]。本研究结果显示胃癌细胞中SOX1表达水平显著低于胃黏膜上皮细胞，说明SOX1可能参与胃癌发生过程。正常生理条件下细胞核中β-catenin表达较低，Wnt信号通路激活后导致大量β-catenin进入细胞核并激活下游靶基因转录进而促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭[11]。相关研究表明胃癌组织中β-catenin蛋白表达显著升高并可促进该病发生、发展，但具体作用机制尚未完全阐明[12]。杨肖军等[13]研究表明成纤维细胞激活蛋白可激活Wnt/β-catenin信号通路进而促进胃癌细胞增殖及迁移。近来相关研究显示SOX1表达水平上调可抑制β-catenin作用进而抑制肿瘤细胞侵袭转移[14]。为了探究SOX1抑癌作用与Wnt/β-catenin信号通路的相关性，本研究在SOX1过表达胃癌细胞中加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂SKL2001，结果显示SOX1过表达组SOX1表达水平显著升高，而β-catenin表达水平显著降低，β-catenin激活剂组SOX1表达水平显著降低，而β-catenin表达水平显著升高，说明胃癌细胞中SOX1过表达后其表达水平升高进而抑制β-catenin表达。同时本研究进一步分析各组细胞增殖情况，结果显示SOX1过表达组SGC-7901细胞增殖抑制率显著升高，而β-catenin激活剂组SGC-7901细胞增殖抑制率显著降低，说明SOX1过表达后可抑制β-catenin促进胃癌细胞增殖的作用。提示SOX1可通过Wnt/β-catenin信号通路进而抑制胃癌细胞增殖。

乳腺癌组织中SOX1呈低表达，上调其表达可显著抑制肿瘤细胞迁移及侵袭能力[15]。Rad等[16]研究表明SOX1过表达后可显著抑制食管鳞癌细胞侵袭能力。SOX家族中SOX2在胃癌细胞中呈低表达，过表达后可下调细胞周期素D1及多聚ADP核糖聚合酶表达进而促进癌细胞凋亡[17]。本研究结果显示SOX1过表达组SGC-7901细胞迁移及侵袭数量均显著降低，β-catenin激活剂组SGC-7901细胞迁移及侵袭数量均显著升高，说明SOX1过表达后可抑制β-catenin对胃癌细胞迁移及侵袭的促进作用。为探讨其具体作用机制，本研究分析Wnt通路中β-catenin等相关蛋白表达，结果显示SOX1过表达组β-catenin、MMP-9蛋白表达均显著降低，而加入β-catenin激活剂后其蛋白表达均显著升高，其中MMP-9还可降解细胞外基质进而促进肿瘤细胞转移、侵袭[18，19]。提示SOX1可通过抑制β-catenin、MMP-9蛋白表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。相关研究表明EMT过程中E-cadherin可抑制肿瘤细胞迁移及侵袭，而N-cadherin作用相反[20]。本研究SOX1过表达E-cadherin表达升高而N-cadherin表达降低，提示SOX1可通过调控β-catenin、MMP-9、E-cadherin及N-cadherin蛋白表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。

综上所述，SOX1可通过抑制β-catenin通路进而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭，有助于为临床治疗胃癌提供新的理论依据。本研究存在不足之处，关于SOX1与β-catenin通路在胃癌发生及发展过程中的具体作用机制有待深入研究。