IL-34在巨噬细胞分化中的作用研究①

刘晓礼 王 昊 张东玥 王丽娜 郑国光

(中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所 实验血液学国家重点实验室 国家血液病临床医学研究中心,天津300020)

IL-34是2008年发现的一种新型白细胞介素[1]，与巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF/CSF1)作用于同一受体CSF1R[2]。IL-34与M-CSF功能有显著重叠，均可促进单核细胞、巨噬细胞以及破骨细胞的增殖、分化和生存[3,4]。然而二者表达具有时空差异[5,6]，且在基因序列和结构上缺少同源性[7,8]，导致功能亦存在差异。有研究报道，IL-34 和 M-CSF均可诱导免疫抑制型巨噬细胞的产生[9]，但两种巨噬细胞在分泌细胞因子及M1/M2极化方面存在差异[10]。目前IL-34 和 M-CSF在病理和生理条件下的功能差异并未完全阐明。本文通过体外诱导小鼠骨髓细胞向巨噬细胞分化实验，研究两者在巨噬细胞分化过程中的作用差异。

1 材料与方法

1.1实验材料 8～10周雌性C57BL/6J小鼠购自实验血液学国家重点实验室实验动物中心。α-MEM培养基、胎牛血清和青霉素/链霉素均购自Gibco公司，重组鼠源M-CSF和IL-34均购于PeproTech公司，TRIzol购自Thermo公司。流式抗体CD11b-PerCp-Cy5.5和Annexin-V/PI细胞凋亡试剂盒购于BD公司，F4/80-APC购于eBioscience公司。引物在华大基因科技股份有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1骨髓细胞培养 取小鼠股骨和胫骨髓腔内细胞，ACK裂解液裂解红细胞后，按1.5×106个/孔均匀铺于12孔板中，用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基于37℃、5%CO2饱和湿度温箱中培养。在骨髓细胞向巨噬细胞分化实验中，用不同浓度(50、100或150 ng/ml)IL-34和50 ng/ml M-CSF作用骨髓细胞3或6 d；在巨噬细胞表型维持实验中，先用50 ng/ml M-CSF诱导骨髓细胞6 d后，再分别用50 ng/ml M-CSF、100 ng/ml IL-34、100 ng/ml LPS和无因子(对照组)条件下继续培养3 d。分别在3、6和9 d取细胞用于实验检测。细胞每3 d换一次液，在第3天换液时，保留悬浮细胞；第6天换液时，弃悬浮细胞。

1.2.2细胞形态观察 将培养3、6和9 d的细胞置倒置显微镜下观察并拍照记录形态。

1.2.3流式细胞仪检测细胞表型 弃培养基和悬浮细胞，用刮刀刮取法收集贴壁细胞，PBS洗1次，用细胞计数板在显微镜下计数后，用1∶100的抗体稀释液重悬细胞，避光冰浴30 min 后，用PBS洗去未结合的抗体并重悬，流式细胞仪检测各组细胞表面分子表达水平，并设置未标抗体的阴性对照组，采用FlowJo10软件分析实验数据。实验重复3次。

1.2.4RT-PCR法检测巨噬细胞极化相关基因表达 收集贴壁细胞，用PBS清洗1次，TRIzol法提取总RNA,测定RNA浓度并逆转录为cDNA。以GAPDH作为内参对照，RT-PCR法测定M-CSF和IL-34诱导巨噬细胞极化相关基因mRNA的表达水平(引物序列详见表1)。反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸34 s，循环48次终止反应。采用2-ΔΔCt法计算极化相关基因mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.2.5Annexin-V/PI法检测细胞凋亡 收集贴壁细胞，用Annexin-V-结合缓冲液重悬后加抗体Annexin-V-FITC，室温避光15 min，加入PI用流式细胞仪检测细胞凋亡比例，采用FlowJo10软件分析实验数据。

2 结果

2.1IL-34对巨噬细胞增殖的作用 用不同浓度(50、100或150 ng/ml) IL-34和50 ng/ml M-CSF作用于骨髓细胞，3 d后，各组均出现带伪足的细胞，其形态无显著差异(图1A)。流式细胞仪分析发现，因子处理组CD11b+F4/80+巨噬细胞的比例和绝对数均显著高于对照组(均P<0.001)，而100 ng/ml IL-34组与M-CSF组比较差异无显著统计学意义；不同浓度IL-34组间比较发现，随IL-34浓度增大巨噬细胞绝对数显著增高(均P<0.01；图1B、C)。作用6 d后，悬浮细胞大部分凋亡，呈长梭形贴壁细胞的比例增多，流式细胞仪分析发现变化趋势与3 d时基本一致(图1A、D、E)。

表1 RT-PCR引物序列

Tab.1 Sequence of RT-PCR primers

GeneForwardReverseGAPDH5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATT-3′5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′IL-12β5′-ATGTGGAATGGCGTCTCTGTCT-3′5′-TGGGCGGGTCTGGTTTGA-3′iNOS5′-CAGCGGAGTGACGGCAAAC-3′5′-AGACCAGAGGCAGCACATCAA-3′Arg15′-CAACCAGCTCTGGGAATCTG-3′5′-AATCGGCCTTTTCTTCCTTC-3′Mmp95′-TGAGTCCGGCAGACAATCCT-3′5′-CCCTGGATCTCAGCAATAGCA-3′IL-105′-CCAGAGCCACATGCTCCTA-3′5′-AGGGGAGAAATCGATGACAG-3′CXCL115′-AGCTGCTCAAGGCTTCCTTA-3′5′-AGTAACAATCACTTCAACTTTGTCG-3′IL-1β5′-TGCCACCTTTTGACAGTGAT-3′5′-TGTCCTCATCCTGGAAGGTC-3′TNF-α5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′5′-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3′CD2065′-CCTGAACAGCAACTTGACCA-3′5′-GCAATGGCCATAGAAAGGAA-3′CSF-15′-TCACAACCTCATCCTTCTGCG-3′5′-GACCCAGTTAGTGCCCAGTGA-3′

从以上结果可得出，IL-34与M-CSF均可促进巨噬细胞的增殖，IL-34的作用呈剂量依赖性，两者诱导的巨噬细胞在形态上无显著差异。

2.2IL-34对巨噬细胞分化相关标记表达的作用 因子作用3 d后，IL-34组巨噬细胞表面标记物CD11b和F4/80表达强度显著低于M-CSF组，峰值左移(图2A)；不同浓度的IL-34组MFI均显著低于M-CSF组(均P<0.05)；而3个浓度的IL-34组之间CD11b的 MFI差异无显著统计学意义(图2B、C)。作用6 d后，结果同3 d时一致，IL-34组CD11b和F4/80表达强度也低于M-CSF组，并且峰值左移更显著，MFI的变化与3 d时一致(图2D、E、F)。从以上结果得出，IL-34与M-CSF诱导的巨噬细胞在分化表型上存在差异。

2.3IL-34对巨噬细胞极化相关基因表达的作用 为探究IL-34与M-CSF诱导巨噬细胞的极化状态，利用RT-PCR方法分析M1型极化相关基因[IL-1β、诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、C-X-C motif趋化因子11(C-X-C motif chemokine 11，CXCL11)、IL-12β和TNF-α]和M2型极化相关基因[细胞分化抗原206(Cluster of Differentiation 206，CD206)、IL-10、精氨酸1 (Arginase 1，Arg1)、CSF-1和基质金属蛋白酶9 (Matrix metallopeptidase 9，Mmp9)]的表达情况。分析结果发现，IL-34诱导巨噬细胞的IL-1β、iNOS和IL-10表达高于M-CSF组(IL-1β,P<0.05;iNOS,P<0.05；IL-10,P<0.01)，而IL-12β表达低于M-CSF组(P<0.01；图3A、B)。以上结果表明，IL-34与M-CSF诱导的巨噬细胞在M1型和M2型极化相关基因表达上存在差异。

2.4IL-34对M-CSF诱导巨噬细胞分化标记的作用 M-CSF诱导6 d的巨噬细胞，用IL-34作用3 d后，CD11b和F4/80的峰值显著左移(图4A)；且两者的MFI均显著低于M-CSF维持组(CD11b，P<0.05；F4/80，P<0.01)；相同的细胞用LPS刺激3 d后，CD11b和F4/80的MFI 均显著高于M-CSF维持组(CD11b，P<0.05； F4/80，P<0.01；图4B、C)。以上结果进一步表明IL-34作用后巨噬细胞的分化表型与M-CSF存在差异。

2.5IL-34对M-CSF诱导巨噬细胞增殖的作用 取M-CSF诱导6 d的巨噬细胞，分别在50 ng/ml M-CSF、 100 ng/ml IL-34、 100 ng/ml LPS或未加因子(对照组)条件下培养3 d。IL-34组与M-CSF组比较发现，IL-34可维持巨噬细胞的形态、比例和数量(图5A～C)，并且凋亡情况比较差异无显著统计学意义(图5D)；而LPS刺激后，细胞形态发生改变，由偏M2型的长梭形变为偏M1型的煎蛋样形状(图5A)，巨噬细胞比例差异虽无显著统计学意义(图5B)，但绝对数有降低趋势(图5C)，早期凋亡显著增高(P<0.01，图5D)。以上结果表明，IL-34可维持巨噬细胞的生存，进一步证明IL-34和 M-CSF在促进巨噬细胞增殖能力上差异无显著统计学意义。

图2 IL-34与M-CSF对巨噬细胞分化表型的作用Fig.2 Effects of IL-34 and M-CSF on differentiation phenotype of macrophageNote: A.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 3；B and C.MFI of CD11b (B) and F4/80 (C) on day 3；D.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 6；E and F.MFI of CD11b (E) and F4/80 (F) on day 6.*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001.

图3 IL-34与M-CSF对巨噬细胞极化相关基因表达的作用Fig.3 Effects of IL-34 and M-CSF on expression of macrophage polarization related genesNote: A.The expression of M1 type polarization related genes in macrophages induced for 6 days；B.The expression of M2 type polarization related genes in macrophages induced for 6 days.*.P<0.05,**.P<0.01.

图4 IL-34对M-CSF诱导巨噬细胞分化的作用Fig.4 Effects of IL-34 on M-CSF induced differentiation of macrophagesNote: A.Flow cytometry analysis of the expression of CD11b and F4/80 on day 9；B and C.MFI of CD11b (B) and F4/80 (C) on day 9.*.P<0.05,**.P<0.01.

图5 IL-34对M-CSF诱导巨噬细胞增殖和凋亡的作用Fig.5 Effects of IL-34 on M-CSF induced macrophage proliferation and apoptosisNote: A.Morphology of bone marrow derived cells on day 9；B and C.the proportion (B) and absolute number (C) of macrophages on day 9；D.the apoptosis was measured by Annexin-V/PI staining.*.P<0.05,**.P<0.01.

3 讨论

巨噬细胞是机体免疫系统重要成员，参与众多生理、病理过程，其功能异常与多种疾病的发生、发展相关，因此探索巨噬细胞在不同疾病条件下的功能异常以及如何使用干预后的巨噬细胞进行疾病治疗成为研究的热点。稳定且易操作的体外获取巨噬细胞的方法是相关研究的前提，M-CSF和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF)是体外由单核细胞诱导分化为巨噬细胞的常用因子，GM-CSF诱导分化的巨噬细胞具有更多M1型的性质，而M-CSF诱导分化的巨噬细胞具有更多M2型的性质[11]。体外诱导的巨噬细胞有多方面的用途，一方面用于体内、体外相关机制研究；另一方面经过进一步体外处理后回输体内进行细胞治疗，如在肾脏移植中，将供者的巨噬细胞输注给受者，可提高移植器官的存活并发挥一定的免疫抑制作用[12]。最近有研究通过慢病毒感染在巨噬细胞导入嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，获得CAR-吞噬细胞，提高巨噬细胞的靶向吞噬能力[13]。IL-34诱导的巨噬细胞与M-CSF诱导的相似，偏向M2型性质，但有研究表明两者诱导的巨噬细胞并不完全一致，功能和表型上的区别尚未阐明。本文旨在丰富巨噬细胞体外诱导体系，并为巨噬细胞应用提供有益的线索。

IL-34主要通过结合CSF1R发挥促进单核细胞增殖、分化和极化的作用[6,14]，目前研究显示IL-34和M-CSF两配体分别与CSF1R结合后，激活的下游信号通路并无显著差异[10,14]。虽然两者在支持巨噬细胞生长和存活上能力相当，但在诱导巨噬细胞分泌单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和嗜酸粒细胞趋化因子等细胞因子能力以及迁移能力上均存在差异[14]。除CSF1R外，IL-34还有另外两个选择性受体，受体型蛋白-酪氨酸磷酸酶ζ (Protein-tyrosine phosphatase zeta,PTP-ζ)和Syndecan-1(CD138)[15，16]，这也进一步暗示IL-34与M-CSF的功能可能并不完全重叠。尽管如此，目前仍未完全阐明IL-34与M-CSF功能上的差异。

之前研究发现，用IL-34和M-CSF诱导外周单核细胞，均可得到免疫抑制型巨噬细胞(IL-10highIL-12low)[17]。本研究利用IL-34与M-CSF刺激小鼠骨髓细胞，发现两者在促进巨噬细胞增殖和存活上功能类似，均能诱导出呈长梭形的偏M2型的巨噬细胞。但进一步分析，发现IL-34诱导的巨噬细胞和M-CSF诱导的巨噬细胞仍存在差异。与M-CSF组对比，IL-34诱导巨噬细胞的分化标志物CD11b和F4/80的表达强度较弱，且随着IL-34诱导浓度的增加有降低的趋势；该现象在用IL-34培养M-CSF诱导的巨噬细胞时也同样出现，IL-34作用后巨噬细胞CD11b和F4/80的表达强度弱于用M-CSF维持组。综上，IL-34与M-CSF诱导的巨噬细胞在分化表型存在差异。

巨噬细胞本身具有很强的异质性和可塑性[18,19]，不同因子将其极化为不同状态，故其功能也存在差异[20]。有研究表明，分别由IL-34与M-CSF诱导的巨噬细胞再经LPS + IFNγ 或IL-4刺激活化后，M1和M2的表型不完全相同，对T细胞和Treg细胞的活化也存在差异[10]。本研究发现，IL-34与M-CSF诱导的巨噬细胞M1型和M2型极化相关基因的表达也并不完全一致。与M-CSF组对比，IL-34诱导的巨噬细胞IL-1β、iNOS和IL-10的表达水平较高，而IL-12β的表达水平较低，这说明IL-34与M-CSF诱导巨噬细胞的极化状态本身就存在差异。

IL-34的表达水平对机体的稳态有重要意义，异常表达与多种疾病相关[2]。目前的研究发现，IL-34表达升高一方面可激活机体免疫系统，与类风湿性关节炎等多种自身免疫病相关[3,21]；另一方面可募集M2性质的巨噬细胞，抑制免疫反应，与多种肿瘤的转移和不良预后相关[3,22]。IL-34在机体中的功能具有争议[3]，尚未研究透彻，仍需要不断地探究。本课题通过研究IL-34与M-CSF对巨噬细胞分化的作用，证实IL-34与M-CSF虽然结合同一受体CSF1R,但功能仍存在一定差异,为采用IL-34或M-CSF诱导巨噬细胞进行基础实验和临床应用提供理论基础，也暗示了IL-34与M-CSF在生理和病理环境中调控的复杂性，为与IL-34、M-CSF相关的疾病治疗提供思路。