乳积方抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7体外增殖的研究

李宏良，田华琴，梁贵文，陈学彰，王斌，杨耀林，黄泳立，朱志霞，陈锡康

广州中医药大学附属佛山中医院肿瘤中心，广东 佛山 528000

乳积方是佛山市中医院肿瘤中心用以防治乳腺癌复发转移的经验方。前期研究发现乳积方对乳腺癌化疗后的患者具有增效减毒及提高机体免疫功能的作用，并可改善乳腺癌术后患者的无疾病生存时间及生活质量[1-3]。为进一步分析乳积方对不同类型乳腺癌的影响，本研究选取乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7进行了以下体外试验。

1 材料

1.1 药物及试剂乳积方由柴胡、白芍、党参、八月札、瓜蒌皮、浙贝、穿山甲、海藻等组成，购自广州至信药业有限公司。RPMI-1640培养液和胎牛血清为GIBCO公司产品。四氮唑蓝（MTT）为Sigma公司产品。

1.2 细胞株人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺正常细胞MCF-10A由中山大学肿瘤医院提供。

1.3 仪器CO2培养箱（一恒BPN-80CH），离心机（中科中佳 SC-3612），超净工作台（新加坡ESCO），倒置荧光显微镜（奥特光学BDS400），自动酶标仪（ThermosMultiskan FC），电子天平（奥豪斯仪器有限公司CP-214）。

2 方法

2.1 药物的制备乳积方由柴胡10 g、白芍15 g、党参15 g、八月札15 g、瓜蒌皮15 g、浙贝10 g、穿山甲10 g、海藻15 g等组成，药材经品种鉴定后用文火煎煮两次，合并药液，过滤，弃去药渣，将滤液煎煮浓缩至每1 ml含生药2 g。取适量药液用无菌水将乳积方配制成2 mg/mL的浓度，以0.22 μm孔径微孔滤膜过滤器过滤除菌，置4℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺正常细胞MCF-10A三种细胞株在37℃，5%CO2饱和湿度条件下，用含有链霉素（50 units/mL），青霉素（100 units/mL）、胎牛血清（10%）等试剂的培养基DMEM培养。根据细胞生长状态达到培养瓶80%空间密度按照常规的细胞传代方法传代。

2.3 分组及乳积方药物处理细胞以人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人乳腺癌细胞MCF-7为观察组，取对数期生长的细胞，按照2.0×104细胞/孔接种于96孔板。在5%CO2和37℃下培养24 h后，细胞单层铺满96孔板底，加入不同浓度梯度（0.2 g/ml，0.1 g/ml，0.05 g/ml，0.025 g/ml，0.0125 g/ml，0.006 25 g/ml）的乳积方药液，每孔100 μl，设3个复孔。37℃，5%CO2饱和湿度条件下处理72 h。倒置显微镜下观察细胞形态的变化且拍照。同时设不加乳积方药液常规培养为空白对照、人乳腺正常细胞MCF-10A为阴性对照。

2.4 MTT实验取待测细胞，于培养体系内加入5 mg/mL MTT液20 ul，置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养4 h。小心吸去孔内培养液，加入每孔150 ul二甲基亚砜（DMSO），微量振荡器振荡10 min。选择570 nm波长，在自动酶标仪上检测各孔光吸收值（OD值）。

2.5 数据分析

2.5.1 细胞存活率的计算 每个MTT实验重复3次取平均值。以每种细胞未经过乳积方药物处理的细胞MTT实验数值为细胞正常值。细胞存活率（%）=（不同浓度乳积方处理后的细胞MTT实验OD值/细胞正常OD值）×100%。每种细胞获得6个浓度下的存活率数据。

2.5.2 半数抑制率（IC50）的计算 对于每种细胞来说，使用以上6个浓度的细胞存活率做线性回归曲线，在细胞存活率为50%时所对应的药物的浓度为IC50值（IC50的数值越小，说明药物杀伤肿瘤细胞的效果越强）。

2.6 统计学方法采用SPSS 13.0软件分析实验数据，采用线性回归处理，求得IC50。

3 结果

3.1 乳积方对人乳腺正常细胞MCF-10A体外增殖的影响

人乳腺正常细胞在体外培养过程中加入不同浓度的乳积方，获得的细胞存活率数据见表1。使用药物浓度与细胞存活率做拟合曲线，得到方程式：y=0.015 01x-0.8143（3R2=0.873）。获得IC50y=50%时对应的x=0.013 498；即细胞存活率为50%时，对应的药物浓度为0.013 g/ml。

3.2 乳积方对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外增殖的影响

图1 乳积方处理MCF-10A细胞72 h细胞倒置显微镜拍照

表1 6个浓度下的人乳腺正常细胞MCF-10A存活率

图2 6个浓度乳积方处理下MCF-10A细胞存活率拟合曲线

人乳腺癌细胞MDA-MB-231在体外培养过程中加入不同浓度的乳积方，获得的细胞存活率数据见表2。使用药物浓度与细胞存活率做拟合曲线，得到方程式：y=-0.308 62 ln 4.449 09x（R2=0.897 13）。获得IC50y=50%时对应的x=0.044 476；即细胞存活率为50%时，对应的药物浓度为0.044 g/ml。

3.3 乳积方对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖的影响

人乳腺癌细胞MCF-7在体外培养过程中加入不同浓度的乳积方，获得的细胞存活率数据见表3。使用药物浓度与细胞存活率做拟合曲线，得到方程式：y=-0.351 51 ln 4.357 06x（R2=0.944 23）。获得IC50y=50%时对应的x=0.055 342；即细胞存活率为50%时，对应的药物浓度为0.055 g/ml。

图3 乳积方处理MDA-MB-231细胞72 h细胞倒置显微镜拍照

4 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，2017年美国癌症协会统计分析，美国新发乳腺癌病例和死亡病例分别达到255 180例和41 070例[5]。在中国，新发的乳腺癌病例和死亡病例也分别高达272 400例和70 700例，并呈持续增长态势[6]。虽然手术、放化疗、内分泌治疗以及新兴靶向治疗已取得很大成效，但复发转移仍是乳腺癌治疗失败的重要原因。

乳积方由柴胡、白芍、党参、八月札、瓜蒌皮、浙贝、穿山甲、海藻等组成。药理研究显示，乳积方中的柴胡富含柴胡多糖，可使细胞吞噬功能增强、自然杀伤细胞功能增强，提高淋巴细胞转核率[7]，对于乳腺癌具有抑瘤转移作用；浙贝有效成分贝母碱，具有抗肿瘤并能够逆转肿瘤耐药[8]；穿山甲能够治疗乳腺疾病、瘰疬、肿瘤等疾病[9]；党参含多种糖类、酚类、甾醇、挥发油、黄芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物碱，具有抗炎、免疫调节以及抗癌等多种生理活性[10]。对化疗放疗引起的白细胞下降有提升作用；山慈菇含有秋水仙碱等多种生物碱[11]，可提高癌细胞中的cAMP水平，抑制癌细胞有丝分裂和癌细胞的增殖[12]，但本品有毒，过量可致胃肠道不适，多发性神经炎，白细胞减少，中枢神经系统抑制，甚至死亡。海藻所含的海藻多糖直接作用于肿瘤细胞，能够激活人体免疫细胞，增强机体免疫功能，并诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖[13]。

表2 6个浓度下的人乳腺癌细胞MDA-MB-231存活率

图4 6个浓度乳积方处理下MDA-MB-231细胞存活率拟合曲线

图5 乳积方处理MCF-7细胞72 h细胞倒置显微镜拍照

表3 6个浓度下的人乳腺癌细胞MCF-7存活率

我们的前期研究发现乳积方联合化疗治疗乳腺癌具有增效减毒及提高机体免疫功能的作用，治疗后无明显骨髓抑制，同时肿瘤相关抗原CA153下降、反映细胞免疫功能的CD3+/HLA-DR+（活化T淋巴细胞）等指标呈明显升高趋势[1]。2013年在乳积方对女性乳腺癌术后患者生存状况的影响研究中发现，长期服用乳积方可以明显有效的预防乳腺癌术后患者的疾病复发、转移，提高生活质量[2-3]。随后还发现乳积方辨证加减对于激素受体阴性、术后、女性浸润性导管癌患者在治疗结束2年内具有一定的改善无疾病生存的作用，对于预防激素受体阴性浸润性导管癌尤其是三阴性乳腺癌术后2年内复发转移具有一定的应用价值[4]。

图6 6个浓度乳积方处理下MCF-7细胞存活率拟合曲线

MCF-10A细胞株来源于人乳腺正常细胞，属非致瘤的上皮细胞株。乳腺癌细胞株MDA-MB-231因其ER、PR及HER-2均为阴性归于三阴性的乳腺癌细胞株，分子分型为基底细胞样型；而MCF-7细胞株的ER、PR阳性、HER-2阴性归于腔上皮型[14]。本研究通过MTT法检测不同浓度的乳积 方（0.2 g/ml，0.1 g/ml，0.05 g/ml，0.025 g/ml，0.012 5 g/ml，0.006 25 g/ml）作用 72 h 后对细胞增殖的影响。倒置显微镜拍照所示，不同浓度处理后的乳腺癌细胞和正常细胞增殖受到了不同程度的抑制。将人乳腺正常细胞MCF-10A及人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7三组细胞的药物浓度与细胞存活率数据做散点图并用趋势线拟合分别得到方程y=0.01501x-0.81433（R2=0.87303），y=-0.308 62 ln 4.449 09x（R2=0.897 13），y=-0.351 51 ln 4.357 06x（R2=0.944 23），其中x代表药物浓度，y代表细胞存活率。计算细胞IC50值时，三种模型对应的药物浓度依次是 0.013 g/ml，0.044 g/ml，0.055 g/ml。其中0.1 g/ml乳积方作用下，MCF-7细胞存活率已经降低到50%以下；而0.044 g/ml乳积方作用下，MDA-MB-231细胞存活率低于50%。提示乳积方制剂对MDA-MB-231细胞具有更显著的细胞增殖抑制作用。

本研究也发现，乳积方对人乳腺正常细胞MCF-10A也存在抑制作用，而在临床研究中并未发现相关的不良反应[1-4]。其原因可能是乳积方中的山慈菇有一定毒性，在体外对正常细胞存在细胞毒作用，但口服中药需经过胃肠道消化吸收、肝脏代谢，体外试验并不能模拟人体对药物的消化吸收及代谢等效应。同时，癌细胞的增殖能力明显强于正常人体细胞，在体外实验中明显看到肿瘤细胞株具有更高存活率，正常人体细胞体外培养相对较难。本研究中MDA-MB-231细胞的IC50值低于MCF-7细胞，说明乳积方制剂对不同的乳腺细胞作用效应有所差异，对MDA-MB-231细胞具有更显著的细胞增殖抑制作用，或提示乳积方对三阴性乳腺癌的某些类型更具应用价值。