巨细胞病毒肝损伤患儿外周血IL-17、IL-35与Th17/Treg的检测及其临床意义

郁晶晶，卜妙然，孟令建，叶黎离，王军

（徐州医科大学附属医院儿科，江苏徐州221002）

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是先天性病毒感染最常见的病原体之一，新生儿及小婴儿属于免疫功能低下的群体，故容易感染HCMV。HCMV常引起多系统播散性疾病或单一组织、器官损害。HCMV肝损伤多见于婴幼儿期原发感染者，是由遗传、免疫和环境等多种原因所致，临床上通常表现为黄疸、肝脾肿大、肝功能异常［1］。

目前，HCMV发病机制尚不十分清楚，可能与机体免疫应答有关。既往研究显示，HCMV感染是多种细胞因子及细胞参与的慢性感染，病毒与机体间相互作用导致机体免疫功能紊乱，而CD4+T细胞在此复杂的免疫应答过程中发挥着重要的效应。产生IL-17A的CD4+T细胞（helper T cells 17，Th17）和CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+regulatory T cells，Treg）的发现打破传统的Th1/Th2细胞效应模式［2］。IL-35是一种新发现的抗炎因子，是Treg细胞发挥免疫抑制作用的重要成分。IL-35与Treg细胞、Th17细胞及IL-17等免疫调节功能密切相关，通过多种途径参与HCMV的发病与调节过程。

关于HCMV肝损后机体IL-17、IL-35和Th17/Treg水平变化及其临床作用国内报道较少。本实验通过检测HCMV肝损伤组、非肝损组与健康对照婴儿外周血Th17细胞和Treg细胞比例及相关细胞因子，探讨其在疾病发生、发展中的作用，为HCMV肝损伤的临床治疗探索新的方向。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至10月在本院儿科诊断为HCMV感染伴肝损伤的20例患儿为肝损伤组，诊断标准参照2012年中华医学会儿科学分会感染消化学组制定的《巨细胞病毒感染诊断方案》［1］，经PCR-DNA定量检测尿液确诊为HCMV病毒感染，均为初发未经抗病毒及免疫抑制剂治疗病例，临床主要以黄疸、肝功能异常就诊。患儿年龄52～337 d，平均（179±64）d，男 12例、女 8例；其中，5例表现为单纯肝功能损害，9例为单纯黄疸，2例为黄疸合并肝功能损害，4例肝功能损害合并肝大。

另外选取同期在年龄、性别分布无统计学差异的38例门诊体检婴儿，其中存在HCMV感染但无肝损者18例作为非肝损组，20例体检正常婴儿且排除HCMV感染者为对照组。3组的年龄、性别构成间的差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。所有入选者均排除胆道闭锁、消化道畸形、其他类型病毒性肝炎（如甲、乙、丙肝炎病毒、EB病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒等感染所致的肝炎）、遗传代谢性疾病、药物性肝炎等。

受试婴儿家长均签署知情同意书，本研究通过医院学术伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

CD4-BB515抗体、APC-CD25抗体、PE-Foxp3抗体、IL-17A-PE抗体、白细胞激活剂组合、Transcription Factor Buffer Set购自上海优宁维生物科技股份有限公司；人IL-17、IL-35 ELISA试剂盒购自徐州康美生物科技有限公司；全自动生化仪与免疫分析仪由我院检验科提供；BD FACSCantoTMⅡ流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 ELISA法检测各组血清IL-17、IL-35浓度

采用EDTA抗凝管抽取实验对象外周血2 mL，3 000 r/min离心10 min，留取血清标本分装于EP管中，部分置-80℃冰箱冻存。按ELISA试剂盒说明书检测IL-17和IL-35浓度。

1.4 血浆转氨酶、尿HCMV-DNA载量检测

上述EP管中部分血清采用全自动生化仪测定丙氨酸转氨酶（ALT）水平；留取测试者3次混合尿液，由我院中心实验室采用荧光免疫PCR法检测尿HCMV-DNA载量。

1.5 流式细胞术检测Treg细胞和Th17细胞比例

将上述剩余血标本用等量PBS液稀释后，加入淋巴细胞分离液1 500 r/min离心20 min，弃上清液，取外周血单核细胞（PBMC）与2μL白细胞刺激剂至24孔板，培养基吹匀细胞后，置于培养箱孵育4 h（37℃、5%CO2），取出离心，弃上清液，将管内剩余物标记，加入50μL PBS，用微量加样仪混匀吹打管内细胞，分别取2μL荧光标记抗体（CD4-BB515抗体、APC-CD25）加入标记为Treg管及Treg对照管，震荡混匀后室温避光孵育30 min；取1 mL PBS加入标记为Th17管及Th17对照管内，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加200μL甲醛于Th17对照管内重悬，置4℃冰箱避光保存；Th17管中加1 mL细胞固定液重悬，室温避光孵育40 min后，用Wash破膜剂固定，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，用1 mL缓冲液洗涤细胞2次；上述4组试管分别加入50μLWash破膜剂，将2μL PE标记的IL-17 A抗体及2μL PE-Foxp3抗体置于相应实验试管，同型对照管加入同型对照抗体进行染色，避光孵育50 min；各试管内加1 mL缓冲液洗涤后1 500 r/min离心5 min，弃上清液，采用流式细胞仪检测Treg细胞、Th17细胞比例，设同型对照用于校正补偿。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，非正态分布资料采用中位数表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，采用Pearson法对各项参数进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALT和尿HCMV-DNA定量

肝损伤组患儿外周血ALT明显高于非肝损组和对照组（P均＜0.05），非肝损组和对照组间无明显差别（P＞0.05）。荧光免疫PCR法检测结果显示，肝损组与非肝损组间HCMV-DNA含量的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 3组婴儿丙氨酸转氨酶和尿HCMV-DNA定量比较

2.2 外周血Th17细胞比例、Treg细胞比例及相关细胞因子浓度

与对照组比较，肝损伤组、非肝损组血清Th17细胞比例、IL-17浓度均明显增高，肝损伤组这两项指标又显著高于非肝损组（P均＜0.01）；肝损伤组、非肝损组外周血Treg细胞比例和IL-35浓度均明显低于对照组，且肝损伤组又显著低于非肝损组（P均＜0.01）。肝损伤组Th17/Treg明显高于非肝损组和正常对照组，差异有统计学意义（P均＜0.01）。见表2和图1。

表2 各组婴儿外周血Th17、Treg细胞比例及相关细胞因子浓度比较±s

表2 各组婴儿外周血Th17、Treg细胞比例及相关细胞因子浓度比较±s

a：P＜0.05，与非肝损伤组比较；b：P＜0.05，与对照组比较

组别 n IL-17（pg/mL） IL-35（pg/mL） Th17细胞（%） Treg细胞（%）Th17/Treg肝损伤组 20 268.22±2.82a，b 41.73±6.02a，b 42.61±5.24a，b 3.59±0.61a，b 12.25±2.77a，b 75.828 28.347 47.209 40.472 39.43 P值非肝损组 18 217.48±1.58b 47.68±4.48b 32.91±5.98b 4.41±0.77b 7.60±1.67b对照组 20 182.62±1.98 57.02±8.18 26.90±4.17 6.65±1.01 4.11±0.70 F值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图1 流式细胞术检测外周血Th17细胞和CD4+CD25+T细胞比例

2.3 相关性分析

外周血Treg细胞比例与IL-35浓度呈显著正相关（r=0.620，P＜0.05）；外周血 Th17细胞比例与血清 IL-17浓度呈显著正相关（r=0.830，P＜0.05）。

3 讨论

肝脏是人体的重要靶器官，容易受外界环境、机体内部免疫紊乱的影响而发生病变。HCMV侵犯肝胆管上皮细胞、内皮细胞后，经抗原提呈和白细胞黏附作用，促使多种细胞参与机体免疫炎症反应，进而加重肝脏损害［3-4］。

Th17细胞是近年来新发现的一种辅助细胞，维甲酸相关孤儿受体 ROR-γt是其主要转录因子。Th17细胞主要由胸腺合成，部分为TGF-β和IL-6诱导T细胞前体分化而成。Th17细胞通过分泌IL-17、IL-22及IL-23等效应因子参与炎症反应、防御胞外病原菌感染［5］。IL-17主要启动T细胞诱导的早期炎症反应，参与免疫调节并发挥较强的炎症介导功能［6］。研究表明，IL-17R是同源信号I型跨膜蛋白质受体，与IL-17结合后可促使产生IL-8和GRO-α，激活MAP激酶磷酸化等多种下游途径［7］，同时招募大量的炎症细胞，促进T细胞的激活。HCMV可激发相关细胞产生细胞因子，募集、活化中性粒细胞，同时刺激Th17细胞分泌IL-17，参与肝脏炎症反应［8-9］。Yasumi等［10］曾提出 IL-17可作为肝脏急性损伤的标志。本实验中，ELISA检测结果显示HCMV肝损患儿外周血中IL-17浓度显著高于另外两组，与孙晓红等［3］的研究结果一致。因此我们认为IL-17可作为衡量HCMV肝损患儿的重要指标。

Treg细胞是机体负向免疫调节应答的重要细胞亚群，在病毒感染过程中通过产生高浓度IL-10和TCF-β等细胞因子，抑制T淋巴细胞及NK等细胞的增殖分化。IL-35是一种新型的抗炎细胞因子，2007年 Niedbala等［11］以及 Collison等［12］的小鼠体内实验初步显示，IL-35主要由Treg细胞分泌。IL-35一方面刺激Treg细胞增殖，另一方面诱导T细胞转化为具有更强抑制活性的调节性T细胞［13］，构成机体强大的免疫调控网络。

既往研究显示IL-35在骨髓增生异常综合征、乳腺癌、心血管等疾病中发挥重要作用。万雪媛等［14］在小鼠模型实验中提出，在MCMV感染急性期IL-35可抑制炎症反应，而在急性感染所致的持续病理损伤过程中发挥着重要保护作用。本实验结果显示，HCMV感染肝损伤患儿Treg细胞比例与IL-35浓度明显下降。因此，我们猜测Treg细胞、IL-35可能在HCMV感染中发挥重要免疫保护作用。

本研究显示，HCMV肝损患儿Treg细胞比例较对照组下降，Th17/Treg平衡被打破，IL-17促进炎症的发生发展，并在肝脏代谢中产生重要反应，从而形成恶性循环，最终导致机体免疫系统紊乱。Th17细胞与Treg细胞都来源于CD4+T细胞，既往研究证实Treg细胞在高浓度IL-6的刺激下可转化成Th17细胞；另外，Treg细胞的特异性转录因子Foxp3与ROR-γt结合，可抑制IL-17 RNA的转录，从而影响Th17细胞的功能［15］。所以，Treg细胞与Th17细胞在分化及免疫应答方面存在相互拮抗作用。Th17细胞主要参与肝脏炎症反应，而Treg细胞主要在慢性病毒感染中表达。有人提出，当出现重型肝炎时，机体Th17细胞及其分泌的IL-17浓度可显著增加，参与炎症反应致肝脏损伤；相应地Treg细胞分化增强，下调免疫反应从而避免肝脏过度损伤［16］；所以，Th17、Treg细胞在维持免疫内环境稳定中发挥重要作用。IL-35能促进IFN-γ合成，并抑制Th17细胞增殖分化，减少IL-17的分泌，从而抑制机体过度的免疫损伤［17］。

综上所述，在巨细胞病毒肝损伤的发生发展过程中，存在多种细胞及细胞因子的参与。以IL-17为主的促炎因子和IL-35为主的抗炎介质引发一系列免疫反应，Th17/Treg的平衡在维持机体免疫内环境稳定中起着重要作用。IL-35是一种具有潜在治疗前景的新型调节因子，能否通过提高IL-35浓度来抑制炎症反应有待探讨；相信随着对IL-35与HCMV关系的深入了解，IL-35在慢性病毒感染中将展现临床应用前景。