核因子E2相关因子2在足月胎膜早破组织中的表达及临床意义

刘佳佳，于骏，谢冰，方杰，栾晓瑾，颜一丹

（1.江苏大学附属医院妇产科，江苏镇江212001；2.江苏大学附属第四人民医院妇产科，江苏镇江212001）

胎膜早破指的是胎膜在临产前的破裂［1］，常伴随多种并发症，如绒毛膜羊膜炎、早产、脑瘫等，早期精准诊断是有效管理和预防并发症的关键［2］。胎膜早破可由多因素引起，包括感染、吸烟、双胎妊娠等［3-4］；炎症—氧化应激在造成胎膜损害的过程中起重要作用［4］。研究表明，局灶性感染和炎症可能在胎膜早破的发病机制中起主要作用［5-6］。破膜部位的炎症改变表明细菌感染可能是胎膜早破的启动者［6-7］。核因子 E2相关因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一种重要的抗炎介质，限制炎症反应［8］。Nrf2通过抑制促炎细胞因子（如TNF-α和IL-6）以及诱导型一氧化氮合酶的表达发挥抗炎作用，但其在胎膜早破中的作用尚不完全清楚。本研究对胎膜早破患者胎膜组织中Nrf2表达水平进行检测，分析其与胎膜早破的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 研究对象选择 本项研究经江苏大学附属医院生物医学伦理委员会批准实施，患者均知情同意。选取在2016年9月至2017年1月入住我院妇产科的30例健康孕妇（对照组）和30例胎膜早破孕妇（胎膜早破组）。其中，对照组平均年龄（26.43±2.67）岁，平均孕周（39.41±0.29）周；胎膜早破组平均年龄（27.47±2.79）岁，平均孕周（39.40±0.28）周；两组年龄和孕周间差异均无统计学意义（P均＞0.05），具有可比性。

1.1.2 诊断标准 胎膜早破的诊断依据中华医学会妇产科学分会产科学组制定的胎膜早破的诊断与处理指南（2015）［9］，在临产前，产妇会感觉有大量阴道流液，有时可见胎脂或胎粪，进行专科检查时可能会有多量的液体自宫颈口流出，阴道pH≥6.5，将阴道液涂于玻璃片上自然干燥，在显微镜下可观察到羊齿状结晶。

1.1.3 纳入及排除标准 纳入标准：均为第一次妊娠且足月，妊娠期在39周～39+6周之间，未临产，单胎，胎位为头位；排除标准：合并糖尿病、高血压、甲状腺疾病、急性阑尾炎等内外科疾病，胎儿窘迫或胎死宫内、前置胎盘等胎儿及胎儿附属物异常。

1.2 胎膜组织及主要试剂

胎盘胎膜娩出后，取胎膜破口处约4 cm×4 cm胎膜组织，生理盐水冲洗表面血迹，将其均匀分成3份，其中2份置于冻存管放入液氮罐中备用，分别用于荧光定量PCR、蛋白质印迹法；另1份立即行甲醛溶液固定，送至江苏大学附属医院病理科，石蜡包埋制成蜡块，制作成5μm切片，用于免疫组织化学检测。

引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成。内参β-肌动蛋白引物序列：上游5′-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3′，下游5′-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3′；Nrf2引物序列：上游5′-TGAGGTTTCTTCGGCTACGTT-3′，下游5′-CTTCTGTCAGTTTGGCTTCTGG-3′。

RNA提取液和BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；反转录试剂盒（美国Thermo公司）；荧光定量PCR试剂盒（上海Roche公司）；多克隆山羊抗人Nrf2抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；多克隆兔抗人Nrf2抗体（英国Abcam公司）；SP试剂盒（北京中杉金桥生物公司）。

1.3 荧光定量PCR检测胎膜组织Nrf2 mRNA表达

按RNA提取液说明书提取胎膜组织总RNA，核酸测定仪测定各样本RNA浓度，配制RNA终浓度为200 ng/μL；按说明书将各样本总RNA反转录为cDNA，反应体系10μL，反应条件：42℃ 60 min；70℃ 5 min。

PCR操作方法按照说明书进行，反应体系25μL，2×浓度的反应混合液12.5μL，7.5μmol/L上游引物和下游引物各1μL，cDNA 2.5μL，双蒸水8μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火60 s；40个循环。以β-肌动蛋白作为内参，采用相对定量方法进行分析，公式2-ΔΔCt计算 Nrf2 mRNA相对表达量。

1.4 蛋白质印迹法检测胎膜组织Nrf2蛋白表达

参考文献［10］，提取胎膜总蛋白，测定总蛋白浓度；水浴变性；制备分离胶、浓缩胶，SDS-PAGE分离蛋白；湿转法300 mA恒流30 min将蛋白转至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；分别加1∶1 000稀释的多克隆山羊抗人Nrf2抗体和内参β-肌动蛋白，4℃孵育过夜；1×TBST洗膜3次；加入1∶3 000稀释的二抗，室温孵育30 min；1×TBST洗膜3次；发光剂荧光显色，成像系统显影；使用PhotoShop和Alpha软件分析目标带的光密度值，并统计分析。

1.5 免疫组织化学法检测胎膜组织Nrf2的定位及表达

采用SP免疫组织化学法，其中阴性对照采用PBS代替一抗。一抗多克隆兔抗人Nrf2抗体稀释度1∶200，按SP试剂盒说明书操作。二甲苯脱蜡；枸橼酸盐缓冲液煮沸行抗原修复；3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶；山羊血清封闭液室温孵育15 min；分别加入多克隆兔抗人Nrf2抗体和PBS，4℃孵育过夜；1∶200稀释的羊抗兔IgG室温孵育30 min；DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察拍片。

SP染色法阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒，阴性对照中无着色。参考文献［11］免疫组织化学反应评分的标准，染色强度：0分为无着色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；染色细胞百分数：0分为＜1%，1分为1%～10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%。染色强度和染色细胞二者评分相乘计为总得分。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，数据符合正态分布，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胎膜组织中Nrf2 mRNA和蛋白的表达

胎膜早破组胎膜组织中Nrf2 mRNA和蛋白表达明显低于对照组（t分别为-9.42，3.79，P＜0.01或P＜0.05），见图1。

图1 Nrf2 mRNA和蛋白在两组胎膜组织中的表达

2.2 胎膜组织中Nrf2的定位及表达量

Nrf2在胎膜组织各层结构的细胞核和细胞质中均可见，其中，Nrf2在羊膜上皮层表达最高。与对照组相比，胎膜早破组的Nrf2在羊膜上皮层、绒毛滋养细胞层和蜕膜层中表达明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。见图2和表1。

3 讨论

Nrf2对于炎症的调节必不可少，在减轻炎症中发挥重要作用［12-13］。Nrf2抗炎作用与其抑制促炎因子等相关［14］。研究发现，在稳态状态下，Nrf2在胞质内发挥作用后经蛋白酶体降解；在应激状态下，Keap1与Nrf2分离，转移到细胞核并激活细胞保护基因［15］。本研究结果显示，Nrf2在胎膜组织各层结构的细胞核和细胞质中均可见，与Deshmukh等［15］研究结果基本一致，提示在胎膜组织各层结构的细胞中，稳态及应激状态共存。由此推测，胎膜早破的发生可能由于稳态与应激状态失衡。

图2 光镜下Nrf2在胎膜组织中的定位及表达

表1 两组胎膜各层组织结构的Nrf2免疫组化评分±s，分

表1 两组胎膜各层组织结构的Nrf2免疫组化评分±s，分

组别 羊膜上皮层 结缔组织层 绒毛滋养细胞层 蜕膜层 F值 P值.06 ＜0.01胎膜早破组 7.20±1.10 4.00±1.41 6.40±0.89 6.00±1.41 6.18 ＜0.01 t值对照组 11.40±1.34 6.00±2.12 10.20±1.64 9.60±2.51 7 5.42 1.75 4.54 2.79 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05

Lim等［16］研究发现Nrf2在人胎膜中具有抗炎作用。本研究结果示胎膜早破组孕妇胎膜组织中Nrf2 mRNA和蛋白表达明显降低，可能致其抗炎功能减弱，从而造成胎膜早破发生。本组健康孕妇和胎膜早破孕妇的胎膜组织中，羊膜上皮层Nrf2表达量均最高。已有研究表明，在炎症刺激时，羊膜上皮层细胞因子表达水平明显高于绒毛滋养细胞层和蜕膜层，可能与羊膜上皮层的组织特异性有关［17］。由此表明，Nrf2在羊膜上皮层的高表达可能在胎膜早破中发病中起着至关作用。

综上，Nrf2在胎膜组织中的表达水平降低可能与胎膜早破的发生发展有关。但并未对Nrf2如何影响胎膜早破具体机制进行深入探讨，后期将进一步研究其中的关键分子及信号通路，以阐明其在胎膜早破发生发展中的作用。