荷瘤小鼠MDSCs中TRIM25和PTEN的表达

宋格，赵耀，陆薇，王胜军

（江苏大学医学院检验医学研究所，江苏镇江212013）

髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是一群骨髓来源的、未成熟的异质性细胞。在正常生理条件下，骨髓中的未成熟髓样细胞（immaturemyeloid cells，IMC）分化为成熟的粒细胞、树突状细胞或巨噬细胞。然而，在炎症、创伤、肿瘤等病理条件下，IMC分化为成熟髓系细胞受到阻碍，停留于不同分化阶段的IMC在体内大量聚集。随后，在肿瘤细胞或炎性细胞分泌的细胞因子的诱导下，IMC分化为具有免疫抑制活性的MDSCs［1］。MDSCs在肿瘤免疫应答中起负向调控作用，有利于肿瘤的发生和发展［2］。已有研究表明，荷瘤小鼠肿瘤来源MDSCs比脾脏来源MDSCs分化成熟度更低、免疫抑制功能更强［3］。

三基序蛋白 25（tripartite motif containing 25，TRIM25）是TRIM家族的成员，具有E3泛素连接酶的功能。作为E3泛素连接酶，TRIM25可催化多种靶蛋白PTEN、p53、RIG-I等发生多聚泛素化修饰，激活一系列信号通路进而调控生物功能［4-6］。它通过泛素化或类泛素化调控细胞活动，在多种癌症中发挥癌基因的作用［7-9］。研究报道TRIM25异常高表达于肺癌、结肠癌、胃癌和乳腺癌等多种癌症［10-13］。TRIM25对免疫系统及免疫细胞都有着重要的调控作用［14］，但 TRIM25是否参与调控 MDSCs，目前尚未有相关文献报道。

PTEN基因编码的蛋白具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双特异磷酸酶活性，是第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因［15］。PTEN基因缺陷在人类多种肿瘤中广泛存在。PTEN通过抑制PI3K/AKT和STAT3信号通路调控MDSCs的免疫抑制功能［16-18］。鉴于E3泛素连接酶TRIM25能够催化PTEN的泛素化修饰，且PTEN在调节MDSCs的扩增、活化和功能中发挥重要作用，本研究中我们联合检测TRIM25和PTEN在肿瘤来源MDSCs中的表达情况，有助于探讨MDSCs的调节机制，寻找肿瘤免疫治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料

实验动物和细胞株：小鼠CT26结肠癌细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。雌性、6～8周龄、体重（20±2）g的SPF级BALB/C小鼠购自江苏大学实验动物中心（合格证编号：NO.201803506）。

主要试剂：DMEM培养基、RPMI 1640培养基和胎牛血清（美国 Gibco公司）；胰酶、Ⅰ型胶原酶、DNA酶、透明质酸酶（Sigma公司）；小鼠MDSCs分离试剂盒（Miltenyi Biotec公司）；生物素标记的抗小鼠/人CD11b抗体（Biolegend公司）；PE/Cy5标记的大鼠抗小鼠/人CD11b单克隆抗体（BioLegend公司）；PE标记的大鼠抗小鼠Gr1单克隆抗体（BD Pharmingen公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（Takara公司）；DL500 DNA分子量标准（Takara公司）。

1.2 构建小鼠CT26结肠癌移植瘤模型

用含10%小牛血清的DMEM培养基培养小鼠CT26肿瘤细胞，放置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，细胞呈贴壁生长。待肿瘤细胞生长至对数期，用胰酶消化计数后备用。接种时，将小鼠置于超净台中，用酒精棉球消毒小鼠背部右侧皮肤，每只小鼠皮下注射约1×106个肿瘤细胞/200μL PBS。待小鼠注射部位触摸到质地较硬、可移动的黄豆大小的皮下结节时，即为移植瘤模型构建成功。

1.3 小鼠脾细胞悬液、肿瘤组织细胞悬液的制备

脾细胞悬液的制备：脱颈处死野生型小鼠，无菌取出小鼠脾脏，置筛网研磨，将细胞悬液移至离心管；4℃、500×g离心5 min后弃上清，加5 mL ACK裂解红细胞，5 min后加5 mL PBE缓冲液终止裂解，再次4℃、500×g离心5 min，弃去上清，留沉淀加PBE缓冲液重悬即可获得脾细胞悬液。

肿瘤组织细胞悬液的制备：接种肿瘤细胞后第28天处死荷瘤小鼠，眼球放血，脱颈处死。无菌剥离荷瘤小鼠的肿瘤组织，将肿瘤组织剪碎后放入50 mL Corning管，用适量的胶原酶消化（每0.25 g肿瘤组织加10 ml胶原酶），37℃水浴箱中消化1.5～2 h，每隔5 min颠倒混匀Corning管；消化结束用筛网过滤，收集滤液；4℃、500×g离心5 min后弃上清液，PBE缓冲液重悬细胞沉淀即获得肿瘤组织细胞悬液。

1.4 小鼠脾脏来源MDSCs的分离纯化

磁珠分选脾脏MDSCs：用300μL PBE缓冲液重悬脾细胞沉淀，加30μL FcR Blocking封闭液，冰上孵育 10 min；加入抗 CD11b Biotion（10μL/108细胞），冰上孵育30 min，10 min混匀一次；加入10mL PBE洗涤，4℃、500×g离心5 min后弃上清液，用300μL PBE重悬细胞沉淀，加 anti-Biotion Microbeads（15μL/108细胞），弹匀后冰上孵育30 min，每隔10 min弹匀一次；加10 mL PBE洗涤，再次离心弃上清，用500μL PBE重悬细胞沉淀。在磁性分离架上安装好LS分离柱，用3 mL PBE润柱后，再向LS分离柱中加入500μL细胞悬液，然后每次用3 mL PBE洗涤分离柱，共洗3次。待悬液滴尽后，取下LS分离柱置于无菌的10 mL离心管上，向柱中加入5 mL PBE，快速推动柱推使细胞流入离心管中，重复操作1次，即可获得10 mL MDSCs细胞悬液。

1.5 流式细胞术分选肿瘤组织来源MDSCs

取制备好的小鼠肿瘤组织细胞悬液，计数，在EP管中用PBS重悬，按照0.25μg/106细胞分别加入 anti-Gr1-PE和anti-CD11b-PE/Cy5，置于4℃冰箱避光孵育30min；加1mL PBS终止染色，4℃、500×g离心5 min后弃上清，用含1%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞，流式细胞仪分选获得CD11b+Gr1+MDSCs。

1.6 RNA提取及反转录

将保存于-80℃冰箱中Trizol裂解的样本取出，放置冰上融化；加入200μL三氯甲烷/1 mL Trizol，剧烈震荡20 s，室温静置10 min；4℃、12 000×g离心15 min；从离心机平稳地取出样本，轻柔地吸取300～400μL上层水相于新的EP管中；加入500μL异丙醇，混匀，室温静置15 min；4℃、12 000×g离心10 min；管底可见白色沉淀，小心弃去上清，加入1 mL用DEPC水配成的75%乙醇洗涤；4℃、7 800×g离心5 min；弃上清液，置室温，待RNA沉淀吹至半透明状，加入10μL DEPC水溶解。核酸检测仪测定RNA纯度和浓度，用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20℃保存备用。

1.7 实时荧光定量PCR检测TRIM25和PTEN的相对表达量

小鼠TRIM25、PTEN及β-肌动蛋白引物由上海生工公司合成。TRIM25上游引物：5′-GAGGATGGAGTGCCATTGTT-3′，下游引物：5′-GGCTGACCTCAACCCTGTAA-3′，预计扩增片段为127 bp。PTEN上游引物：5′-AGGCACAAGAGGCCCTAGAT-3′，下游引物：5′-CTGACTGGGAATTGTGACTCC-3′，预计扩增片段为74 bp。

β-肌动蛋白上游引物：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物：5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，预计扩增片段为349 bp。

实时荧光定量PCR扩增体系为：2×SYBR Premix ExTaq5μL；ddH2O 3.4μL；正向引物、反向引物各0.3μL；cDNA 1μL，总体系为10μL。实时荧光定量PCR反应条件：预变性95℃10 min；变性95℃ 15s；退火60℃ 30 s；延伸72℃ 30 s；进行35个循环扩增，72℃ 7 min充分延伸。TRIM25和PTEN的相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.8 琼脂糖凝胶电泳

用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，将4.5μL样本与0.5μL 10×上样缓冲液的混合液加至加样孔中，另一加样孔中加入5μL DL500 DNA标准参照物。电压110V电泳40 min左右，将凝胶放入EB染液染色10 min，清水冲洗10 min，曝光成像拍照。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0软件进行制图，SPSS 19.0软件进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，运用独立样本t检验进行两组之间的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠来源MDSCs纯度的鉴定

磁珠分选野生型小鼠脾脏来源MDSCs，流式细胞术分选荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs，采用流式细胞仪鉴定MDSCs的纯度。野生型小鼠脾脏来源MDSCs和荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs的纯度均达90%以上。见图1。

图1 流式细胞术鉴定MDSCs纯度

2.2 TRIM25、PTEN基因定量PCR扩增产物的鉴定

TRIM25、PTEN的实时荧光定量PCR扩增曲线呈典型 S型，CT值（cycle threshold，CT）在18～28之间，说明模板cDNA浓度合适；实时荧光定量PCR熔解曲线呈单峰，表明两基因的引物特异性好；同时，琼脂糖凝胶电泳显示TRIM25、PTEN扩增产物的片段均为单一的特异性条带，且扩增片段大小符合预期。说明MDSCs中存在 TRIM25、PTEN的表达。见图2。

2.3 TRIM25在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中高表达

qRT-PCR检测结果显示，与野生型小鼠脾脏MDSCs相比，TRIM25在荷瘤小鼠肿瘤来源MDSCs中的表达水平显著升高（t=4.566，P＜0.001），表明TRIM25在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中高表达。见图3。

图2 TRIM 25、PTEN基因PCR扩增产物的鉴定分析

图3 TRIM 25在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中高表达

2.4 PTEN在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中表达水平下降

qRT-PCR检测PTEN的表达水平。结果表明，与野生型小鼠脾脏来源MDSCs相比，荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中PTEN的表达水平明显下降（t=8.881，P＜0.001），表明PTEN在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中表达水平下调。见图4。

图4 PTEN在荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中表达下调

3 讨论

近年来，MDSCs已成为肿瘤微环境中抑制免疫应答的主要细胞。MDSCs是一种由大量未成熟的骨髓前体细胞组成的异质性群体，在病理状态下被激活，并显示出强大的免疫抑制活性［19］。MDSCs能够抑制效应性T细胞和NK细胞的抗肿瘤免疫应答，在肿瘤的发生、发展及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。正常小鼠的脾脏中仅有2%～4%CD11b+Gr1+细胞，而荷瘤小鼠脾脏中MDSCs的比例可达20%～40%，并在肿瘤局部检测到MDSCs的大量聚集［20］。有文献报道，与小鼠脾脏来源MDSCs相比，肿瘤局部来源MDSCs发挥更强的免疫抑制功能［21］。肿瘤局部MDSCs的产生和功能的调节是一个复杂的过程，目前已发现多种信号通路参与MDSCs的调控，如 STAT家族、C/EBP、NF-κB和PTEN/PI3K/AKT等通路，但具体的分子机制尚不十分清楚［22］。因此，我们想探究MDSCs的调控机制，为靶向MDSCs的肿瘤免疫治疗提供理论基础。

PTEN是继p53之后发现的一个极其重要的抑癌基因。PTEN的突变或缺失与肺癌、结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌等多种肿瘤的发生密切相关。MDSCs是肿瘤微环境中的主要抑制性细胞，PTEN参与调控MDSCs的扩增、活化和功能。大量的研究表明，肿瘤微环境中多种miRNA通过靶向抑制PTEN，活化 PI3K/AKT/mTOR或STAT3信号通路，促进MDSCs的扩增和免疫抑制功能［16-18］。Garcia等［23］发现前列腺上皮细胞PTEN的缺失会诱导肿瘤微环境中MDSCs的扩增和活化，从而促进前列腺癌的进展。我们的实验结果显示PTEN在肿瘤MDSCs中表达下调，这与以上的研究报道相一致。但PTEN对MDSCs调控的具体机制仍需继续探讨。

最近的研究发现E3泛素连接酶参与调控MDSCs的扩增、活化或功能。Tarcic等［24］指出E3泛素连接酶RNF20缺陷小鼠体内的MDSCs招募和激活增强，且这群MDSCs有很强的免疫抑制活性，抑制RNF20可能会促进慢性炎症的发生和随后肿瘤的进展。TRIM25作为一个重要的E3泛素连接酶，与肿瘤关系密切，在多种肿瘤组织中高表达。TRIM25对免疫细胞也有调控作用。我们的研究发现肿瘤组织来源MDSCs中TRIM25高表达，提示TRIM25可能正向调控 MDSCs的扩增、活化或功能。由于TRIM25、PTEN主要在蛋白水平发挥作用，接下来我们会进一步检测两者在MDSCs中的蛋白表达情况。此外，有研究证实TRIM25通过促进PTEN的K63位多聚泛素化，抑制其磷酸酶活性，促进了非小细胞肺癌的发生和发展［25］。那在肿瘤局部 MDSCs中，TRIM25是否通过介导PTEN泛素化，从而调控MDSCs的扩增、活化或功能，最终影响抗肿瘤免疫应答？这一问题我们将在之后的工作中继续研究和探讨。