高脂饲料诱导幼鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

林敏华 邓桂清 欧宇轩 陈芷琳 黄佳栓 康美霞 李锦新

1 广州医科大学儿科学院，广东省广州市 511436； 2 广州医科大学第三临床学院；3 广州医科大学市一临床学院； 4 广州医科大学第一临床学院； 5 广州医科大学基础医学院

儿童型非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种除外酒精及其他明确肝损害因素，以肝细胞弥漫性脂肪变为主要特征的临床病理综合征[1]。我国儿童型NAFLD发病率为3.4%，随着儿童超重、肥胖发生率增加，NAFLD已成为我国儿童最常见的慢性肝病之一[2]，若NAFLD长期迁延不愈，可导致患儿在成年时罹患心脑血管病、糖尿病等疾病的风险增高。目前尚未证实何种药物治疗儿童型NAFLD有效，有关发病机制、药物治疗研究甚少。基础研究方面，儿童型NAFLD造模文献也较少。因此本实验通过高脂饮食诱导建立幼鼠NAFLD模型，为基础研究提供可靠且病变符合儿童型NAFLD的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物 3周龄雄性SD幼鼠SPF级，体质量50～80g，由广东省实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 丙氨酸氨基转移酶试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒，葡萄糖试剂盒，甘油三酯试剂盒，总胆固醇试剂盒，高密度脂蛋白试剂盒，低密度脂蛋白试剂盒, 上海科华生物工程股份有限公司；大鼠胰岛素(INS)ELISA Kit，武汉基因美生物科技有限公司；7020型全自动生化分析仪，日本日立公司；ST-360型酶标分析仪，上海科华实验系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 饲料的制备：委托广东省实验动物中心制备高脂饲料，能量为5.24kcal/g，具体配比为：酪蛋白≥88%为200g/kg，L-胱氨酸为3g/kg，麦芽糖糊精为125g/kg，蔗糖为68.8g/kg，纤维素为50g/kg，豆油为25g/kg，猪油为245g/kg，矿物质AIN-93为35g/kg，维生素AIN-93为10g/kg，氯化胆碱为2.5g/kg；普通饲料能量3.4kcal/g，购自广东省实验动物中心。

1.3.2 动物模型的制备：3周龄雄性SD幼鼠16只，随机分为对照组和造模组，每组8只。适应性饲养3d后，对照组每天喂养普通饲料，造模组每天喂养高脂饲料，每组予自由饮水和自由进食，连续饲养6周。广州医科大学实验动物中心提供清洁无尘、适宜温湿度、良好采光的饲养环境。

1.4 观察指标

1.4.1 一般情况：实验期间，观察大鼠生活习性、毛发颜色、行为习惯等特点，每周记录幼鼠体重及进食量。

1.4.2 肝脏质量与肝指数： 6周后，大鼠禁食24h，腹腔注射1%戊巴比妥4mg/kg麻醉，心脏采血5ml，取肝称重。肝指数=(肝脏质量/体质量)×100%。

1.4.3 血清生化指标检查： 检测血清中门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血糖(GLU)、胆固醇(CHO)、胰岛素(INS)含量，计算胰岛素抵抗(HOMA-IR，HOMA-IR=GLU×INS/22.5)。

1.4.4 肝组织病理学检查： (1)石蜡切片与HE染色：新鲜肝脏用bouin液固定24h，经梯度酒精脱水，TO透明剂透明，石蜡包埋，切片后，行HE染色。镜下观察脂肪变情况并进行NAFLD活动度评分(NAFLD activity score，NAS)，评分标准参照美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组指南。(2)冰冻切片与油红染色：新鲜组织用4%多聚甲醛固定，经梯度蔗糖溶液脱水，OCT包埋，冰冻切片后，行油红染色。观察肝组织脂质沉积情况。

2 结果

2.1 一般情况 实验期间，造模组体质量增长较对照组稍快(图1)，每周平均进食热量均高于对照组(图2)，每周平均进食量均低于对照组(图3)。6周后，造模组体质量显著高于对照组(P<0.01)，见表1，大鼠毛发稍蓬松，毛色变暗。

图1各组幼鼠每周体重增长变化曲线 图2各组幼鼠平均进食热量曲线 图3每周每只幼鼠进食总量变化曲线

2.2 肝脏质量与肝指数 对照组肝脏呈红褐色，边缘尖锐，质地柔软，富有弹性。造模组肝脏体积增大，外表可见广泛分布的黄色细颗粒，肝脏色泽暗沉，边缘厚钝，有油腻感，弹性较差，造模组肝脏质量、肝指数均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 血清相关指标 造模组GLU较对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；造模组HOMA-IR较对照组显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；造模组 AST、ALT、HDL、LDL、TG、CHO、INS 较对照组均有所上升，差异无统计学意义，见表1。

表1 高脂饮食对幼鼠各项指标的影响

注：与对照组相比，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 肝组织病理学改变

2.4.1 HE染色。光镜下观察对照组幼鼠肝组织(图4)，显示正常肝组织结构。造模组幼鼠肝细胞体积增大，细胞质中出现大小不等的脂肪空泡，细胞核被推向一边，部分区域可见炎细胞浸润(图5)。

NAS评分：造模组评分显著高于对照组(P<0.01)，且造模组中87.5%大鼠肝脂肪变程度>33%，提示可诊断为NAFLD，见表2。

2.4.2 油红染色。对照组肝组织几乎无着色，造模组肝细胞中的脂滴被染成橘红色(图6)。

3 讨论

图4 对照组(HE染色，×400)

图5 造模组(HE染色，×400)

组别肝细胞脂肪变<5%5%～33%34%～66%>66%总分(x±s)对照组62000.25±0.46造模组01342.37±0.74∗

注：与对照组相比，*P<0.01。

图6 造模组(油红染色，×400)

目前认为二次打击是NAFLD主要发病机制，胰岛素抵抗引起肝脏中脂质堆积，是NAFLD的第一次打击，第二次打击是氧化应激与脂质过氧化损伤。长期食用高脂饲料的幼鼠极易发生IR[8]，游离脂肪酸(FFA)增多,脂类物质转运障碍，脂类物质CHO、TG蓄积于肝脏，VLDL也相应增加。过量的FFA有肝细胞毒性，可加速线粒体β氧化，产生大量的活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)触发过氧化反应，形成脂质过氧化物；脂质过氧化物增强ROS毒性并减少ROS灭活；如此一来，形成了ROS增多和脂质过氧化增多的恶性循环[9-11]，最终脂质大量累积，发展为非酒精性脂肪肝病。

从发病机制来看，造模组幼鼠肝重与肝指数较对照组高，与脂肪物质对肝细胞的毒性作用有关。肝组织出现炎症浸润和脂肪变，因为脂质积聚可增加促炎细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)[12]，这些炎症因子的升高也可提示肝组织的病变情况[13]。

部分NAFLD患儿会伴随有血脂与肝酶的异常和胰岛素抵抗，然而造模组AST、ALT、HDL、LDL、TG、CHO、INS等有上升趋势但差异无统计学意义。可能是因为并非所有患儿均表现为肝酶谱和血脂代谢的异常，故目前肝酶谱和血脂指标都不作为独立的诊断标准[14]，特别是ALT，在临床上尽管ALT正常也不可轻易排除NAFLD，ALT正常的患儿仍可有肝组织脂肪变[15]。另外，随着胰岛素敏感性和糖处理能力下降，患儿容易并发高血糖和高胰岛素血症[16]。虽然造模组INS差异无统计学意义，但GLU和HOMA-IR差异均有统计学意义，而且HOMA-IR被认为与NAFLD存在正相关关系[17]。

本研究造模组体质量、肝质量和肝指数明显增高，病理改变、NAS评分结果符合儿童型NAFLD的病理特征，存在高血糖、胰岛素抵抗现象，证明高脂饮食可诱导幼鼠NAFLD，可为未来该病发病机制、防治等方面研究提供可靠的动物模型。