白藜芦醇对脑出血和小胶质细胞的作用研究

杨 鸣 杨文臣

作者单位：黑龙江省齐齐哈尔市第一医院 神经内三科 161000

脑血管相关疾病是神经内科常见的脑血液循环障碍性疾病，发病率和致死率呈逐年增高的趋势[1]。目前，脑血管相关疾病已成为威害中老年人健康的首要疾病[2]。脑出血(ICH)是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，是脑血管疾病中最凶险的疾病之一，致死率远高于缺血性脑血管病[3]。脑出血的死亡率在3个月内高达20%左右，即使患者幸存下来，他们大多伴有严重的神经功能缺损和认知功能障碍，严重影响患者生活质量[4,5]。目前，虽然脑出血的病理机制尚不清楚，但大多数学者认为，小胶质细胞介导的炎症反应在血脑屏障破坏、脑水肿、氧化应激等中发挥重要作用。

小胶质细胞是中枢神经系统主要免疫细胞，也是脑组织的常驻守卫细胞[6,7]。当发生脑出血时，血液中的免疫物质进入脑组织形成炎性反应并激活小胶质细胞[8]。小胶质细胞激活能够分泌大量的趋化因子、炎症因子、蛋白酶以及其他细胞毒性产物，增加循环血液中的炎性细胞聚集，放大炎症反应而加重神经细胞损伤[9]。因此，小胶质细胞在脑出血的进程中起着关键作用。本研究探讨白藜芦醇(RES)对小胶质细胞和脑出血的作用，为临床治疗脑出血提供依据和基础。

1.材料与方法

1.1 实验动物和药物处理 购买90只SD大鼠(北京维通利华生物有限公司，中国)，适应环境1周后将SD大鼠随机分为对照组、脑出血模型组和脑出血模型+白藜芦醇组，每组30只，采用Rosenberg法进行大鼠脑出血模型的构建。脑出血模型组SD大鼠按照300mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛。麻醉后，剥离大鼠骨膜，取大鼠自体不凝血80μl，慢慢注入左侧大鼠尾状核部位，并缝合切口部位。对照组SD大鼠不注血，其余步骤同上；脑出血模型+白藜芦醇组，给予白藜芦醇(30mg/kg)，其余步骤同上。48h后取三组大鼠脑组织进行后续研究。

1.2 神经功能评分 根据Clark评分法，评价三组大鼠神经功能受损情况，主要包括身体对称性、步态、攀爬、转圈试验、前肢对称性，每项评分范围为(0～4)分，共(0～20)分，神经功能障碍越重时评分越高。

1.3 脑组织含水量测定 记录大鼠体重后，按照300mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛，用200ml生理盐水和4%多聚甲醛(索莱宝，中国)将大鼠脑组织灌注固定，取出脑组织，分离左右大脑半球，用电子天平立即称取脑组织重量，即湿质量；然后将脑组织放入100℃电烤箱中，24h后称取脑组织重量，即干质量。计算脑含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.4 脑组织血肿体积评估 采用冰冻切片检测脑组织血肿体积。将大鼠脑组织灌注固定后，用冰冻切片机以100μm的厚度进行连续切片。用相机拍摄，并用Image-Pro Plus分析每张切片的血肿面积。计算血肿体积=每张切片血肿面积×0.1mm×层数。

1.5 大鼠小胶质细胞的培养 将SD乳鼠浸泡于75%乙醇中，用眼科弯剪剪去乳鼠头部取脑，并将置于含有10%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺的DMEM培养液(Corning，美国)中。剥去脑部表面的血管和脑膜，并用直剪和弯镊将脑组织剪成碎片，并将脑组织碎片在4℃条件下，1000r/min，离心10min。离心后弃净上清，在37℃条件下，用胰酶(碧云天，中国)消化30min。此外，加入Dnase(Thermo，美国)后用吸管反复吹打混匀。静置10min后，4℃条件下，1000r/min，离心10min。并将细胞接种于多聚赖氨酸涂布后的培养瓶，培养于DMEM培养液中。培养1周后，向细胞培养瓶中加入Dnase，置于摇床上旋转，使小胶质细胞和星形胶质细胞分离，将上清置于离心机中，1000r/min，离心10min，此时获得小胶质细胞，分组为对照组和白藜芦醇组，进行后续实验。

1.6 CCK-8实验 将小胶质细胞接种于96孔板中，次日给予浓度为25μM的白藜芦醇处理，24h后应用CCK-8试剂盒(同仁，日本)，在450nm波长处检测细胞活性。

1.7 ELISA检测 严格按照ELISA试剂盒(Proteintech，美国)说明书，检测大鼠脑组织血肿周围和细胞中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表达。

2.结果

2.1 白藜芦醇对脑出血大鼠神经功能评分的影响 与对照组相比，脑出血模型组神经功能评分显著升高，而脑出血模型+白藜芦醇组神经功能评分显著低于脑出血模型组，但高于对照组(图1)。

图1 三组大鼠神经功能评分比较

2.2 白藜芦醇对脑出血大鼠脑组织含水量的影响 与对照组相比，脑出血模型组脑组织含水量显著升高，而脑出血模型+白藜芦醇组脑组织含水量显著低于脑出血模型组，但高于对照组(图2)。

图2 三组大鼠脑组织含水量比较

2.3 白藜芦醇对脑出血大鼠脑组织血肿体积的影响 与对照组相比，脑出血模型组脑组织血肿体积显著增加，而脑出血模型+白藜芦醇组脑组织血肿体积显著低于脑出血模型组，但高于对照组(图3)。

图3 三组大鼠脑组织血肿体积比较

2.4 白藜芦醇对脑出血大鼠脑组织血肿周围炎性因子的影响 与对照组相比，脑出血模型组脑组织血肿周围炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表达显著升高；与模型组相比，脑出血模型+白藜芦醇组组织血肿周围炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的表达显著降低(图4A～4D)。

图4 三组大鼠脑组织血肿周围炎性因子水平比较

2.5 白藜芦醇对小胶质细胞活性的影响 与对照组小胶质细胞相比，给予白藜芦醇后小胶质细胞活性无变化(图5)。

图5 两组细胞活性比较

2.6 白藜芦醇对小胶质细胞炎性因子的影响 与对照组小胶质细胞相比，给予白藜芦醇后小胶质细胞炎性因子显著降低(图6A～6D)。

图6 两组细胞炎性因子水平比较

3.结论

脑出血后血肿周围脑组织内发生一系列的继发性脑损伤，正常神经元可能变成凋亡神经元或发生坏死，进而引起神经功能障碍[10,11]。大多数研究认为炎症反应使脑出血后引起继发性脑损伤的主要原因[12,13]。目前，脑出血的治疗仅限于血压控制、颅内压治疗和血肿清除术，并不能尽快控制脑出血后炎症反应和继发性脑损伤[14,15]。因此，寻找一个有效治疗脑出血后炎症反应或继发性脑损伤的药物尤为重要。

本研究中，神经功能评分、脑组织含水量评测定、脑组织血肿体积评估结果表明，给予白藜芦醇能够减轻脑出血模型组大鼠神经功能损伤，降低脑组织含水量，抑制脑组织血肿体积的增加，有效改善脑出血后的脑损伤。ELISA实验结果表明，白藜芦醇能够降低脑出血模型组大鼠脑组织血肿周围炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的水平，这些炎性因子的表达是炎症反应的主要标志，表达水平的降低说明白藜芦醇能够抑制脑出血后脑组织炎症反应的发生。据报道，脑部的炎性反应主要由小胶质细胞分泌和释放[16]。因此，我们继续检测白藜芦醇对小胶质细胞活性和炎性因子表达的影响。CCK-8结果表明，白藜芦醇并不影响小胶质细胞活性。ELISA实验结果表明，白藜芦醇能够显著降低小胶质细胞炎性因子表达水平。因此，我们认为白藜芦醇可能通过抑制小胶质细胞炎性因子表达，抑制脑出血后炎症的发生，进而改善脑出血后继发性脑损伤。

综上所述，白藜芦醇可能抑制小胶质细胞分泌和释放炎性因子，抑制脑内炎症的发生，进而对脑部具有保护作用。