消痰化瘀中药对NAFLD 大鼠SREBP 1c/FAS/ACCmRNA 表达的影响※

鲍新民 郭建利 刘晨旭 路 帅 韩 雪 娄丽娟 张一昕

（1 河北省定州市人民医院感染科，河北 定州 073000；2 石家庄医学高等专科学校中医系，河北 石家庄 050599；3 河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200；4 河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，河北 石家庄 050200）

近年来，随着人们在享受富足物质生活条件的同时，肥胖和代谢综合征已经成为临床的常见疾病，随之引发的非酒精性脂肪性肝 （nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD） 已经成为我国排位于病毒性肝炎之后的第二位的肝病，其发病率高居不下，年龄日趋年轻化，可进一步进展为脂肪性肝炎、乃至脂肪性肝硬化。目前临床治疗NAFLD 尚未见特效药物，而大量临床资料表明，中医药在防治该疾病中具有较好治疗优势。消痰化瘀中药乃是经课题组多年临床筛选、用于治疗NAFLD 具有良好效果的组方［1-2］，但其作用机制未明，为此通过动物实验观察了其对NAFLD 大鼠肝组织胆固醇调节元件结合蛋白1c（terolregulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS） 和乙酰辅酶A 羧化酶 （acetyl CoA carboxylase，ACC） 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 雄性大鼠60 只，8 周龄，体质量（180 ± 20） g，由河北省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（冀） 2013-1-003 ，饲养条件为：清洁级实验室，温度为 （23±2） ℃，湿度为50%±10%，12 h 明/暗交替，动物自由饮水进食。

1.2 实验仪器Humalyzer2000 型半自动生化分析仪（德国毫迈克公司）；PE9600 型PCR 扩增仪（美国PE 公司）；DYCZ-24DN 型电泳仪、DYCP-31CN 型电泳槽（北京六一生物科技有限公司）；GDS-8000 System 型UVP 凝胶成像系统（美国Thermo 公司）；UV-254 型紫外透射仪（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；MDF-382E 超低温保存箱（日本SANYO 公司） 等。

1.3 药品与试剂 消痰化瘀中药由清半夏（批号：7080863）、丹参 （批号：7111113）、泽泻 （批号：7126343）、海藻 （批号：5102213）、郁金 （批号：7121973）、柴胡 （批号：7112393）、生大黄 （批号：7090523）、生黄芪（批号：7110743）、炒白术（批号：8010023） 组成，均为广东一方制药有限公司生产的配方颗粒。用100 ℃蒸馏水充分溶解后备用。东宝肝泰片（通化东宝药业股份有限公司，批号为20140613），制成混悬液备用。三酰甘油（TG，批号170824）、总胆固醇（TC，批号170616）、游离脂肪酸（FFA，批号170721）试剂盒（北京中生生物工程高技术公司）；谷丙转氨酶（ALT，批号170611）、谷草转氨酶（AST，批号170621）试剂盒（贝克曼库尔特实验系统有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；DEPC（Sigma 公司）；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker（TaKaRa 公司）。

1.4 模型制备 参照相关文献［3］方法制备高脂饲料，高脂饲料由猪油、胆固醇、基础饲料组成，用量比例分别为10%、2%、88%，造模大鼠每天给予高脂饲料喂养，自由饮水，共计8 周。

1.5 分组与给药 按随机数字表法将60 只实验大鼠随机分为6 组，每组10 只，分别是正常组、模型组、阳性药（东宝肝泰） 对照组和消痰化瘀中药高、中、低剂量组。除正常组给予大鼠普通饲料维持饲养以外，其余各组均喂饲高脂饲料，同时即予相应的药物灌胃，阳性药组和消痰化瘀中药高、中、低剂量组的给药剂量标准分别为：0.9 g/kg、43.34 g/kg、32.50 g/kg、21.67 g/kg，动物给药剂量换算参照陈奇主编的《中药药理研究方法学》之中关于人和动物间体表面积折算比值计算，非用药组大鼠均灌服蒸馏水，每天1 次，用药体积均为1 mL/100 g，连续8 周。

1.6 血清指标检测 实验最后一天给药后所有大鼠隔夜禁食，麻醉后股动脉采血，常规分离血清。用半自动生化分析仪，检测血清TG、TC、FFA、ALT、AST 的含量或活性。

1.7 肝组织指标检测 实验大鼠股动脉采血后，迅即剖腹取出肝脏，滤纸吸去表面液体，称取肝重，计算肝指数（肝湿重/体质量×100%）。取适当大小肝组织，制成10%的匀浆，吸取上清液，用722 型光栅分光光度计检测TC和TG 的含量。

1.8 病理学观察 取适宜大小的肝组织，4% 多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE 方法染色，显微镜下观察肝组织病理形态学变化。

1.9 PCR 检测 实验大鼠麻醉状态下，股动脉采血后迅即剖腹取出肝脏，滤纸吸去表面液体，取少许肝组织置于冷冻管液氮保存。实验时将肝组织解冻，肝细胞总RNA 提取采用Trizol 一步法。引物序列由primer 5.0 软件设计。SREBP1c：上游引物5'-GCCATGGATTGCACATTTGAAGAC-3'， 下 游 引 物5'- GAGGGAAGCTCGGAGGCAAC-3'，扩增片段为379 bp。ACC：上游引物5'-TGCAAACACATCGAGGACGA-3'；下游引物5'-ATGATGGGGACTGGGCTTTG-3'，扩增片段为431 bp。FAS：上游引物5'-GTGAGCGGGAAAGTGTACCA-3'， 下 游 引 物 5'-TCATCTTCAGCCCTTGCTGG-3'，扩增片段为622 bp。β-Actin：上游引物5'-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3；下游引物5'-AACACAGCCTGGATGGCTAC-3'；扩增片段为481 bp。应用RT-PCR 方法检测，实验重复3 次，以β-Actin 作为内对照，计算相对含量。

1.10 统计学方法 数据用SPSS 19.0 软件处理，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 检验，结果采用均数±标准差（x±s）表示。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理形态学的变化 正常组大鼠细胞结构正常，细胞核清晰可见，胞浆均匀。模型组大鼠细胞可见气球样变，胞浆疏松，呈现有大小不一的较多脂滴空泡，表现为明显肝脂变特征。各给药组肝细胞脂滴空泡明显减少，气球改样变减轻，肝脏脂肪变性程度明显改观。见图1~6。

图1 正常组

图2 模型组

图3 高剂量组

图4 中剂量组

图5 低剂量组

图6 阳性药组

2.2 各组大鼠血脂和肝功能的变化 模型组大鼠TC、TG、FFA、ALT、AST 的含量或活性明显高于正常组（P＜0.05）。阳性药组和高、中、低剂量组上述指标的含量或活性均低于模型组（P＜0.05）；其中高、中、低3 个剂量组TC、TG和FFA 的含量均低于阳性药组（P＜0.05）；高剂量组ALT和AST 的活性均低于阳性药组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血脂和肝功能组间比较 （x±s）

2.3 各组大鼠肝脏指数和肝匀浆脂质的含量变化 模型组大鼠肝匀浆TC、TG、FFA 的含量和肝脏指数明显高于正常组（P＜0.05）；阳性药组和高、中、低剂量组TC、TG、FFA 的含量和肝脏指数均低于模型组（P＜0.05）；其中，高、中、低3 个剂量组肝组织TC、TG、FFA 的含量和肝脏指数均低于阳性药组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝脏指数和肝匀浆脂质的组间比较 （x±s）

2.4 各组大鼠肝组织SREBP 1c、FAS 和ACC mRNA 的表达变化 模型组大鼠肝脏SREBP 1c、FAS 和ACCmRNA 的表达明显低于正常组（P＜0.05）；阳性药组和高、中、低剂量组SREBP 1c、FAS 和ACCmRNA 的表达水平均明显高于模型组（P＜0.05）。高剂量组ACCmRNA 的表达低于阳性药组（P＜0.05）。低剂量组中FAS 和ACCm－RNA 的表达低于高剂量组（P＜0.05）。见表3、图7。

表3 各组大鼠SREBP 1c、FAS 和ACC mRNA 表达的组间比较（x±s）

图7 各组大鼠肝组织SREBP 1c、FAS 和ACCmRNA 表达的凝胶电泳图

3 讨论

中医学中无NAFLD 的病名，根据表现特征可归属于中医的“胁痛”“痰浊”“肝着”等范畴，其发病原因较多。课题组结合多年临床研究分析，认为食物精肥甘美、情志郁闷不遂、身体怠惰懒动为其主要病因，日久累积于肝脾，致脾运失常、肝失疏泄，渐至气血失和，湿聚痰生，络脉瘀阻，痰浊、瘀血互结于肝而发为本病。故而痰瘀结聚、肝脾失调为其发生机制，祛除痰瘀、悦肝运脾为其有效治法。故潜心筛选化痰祛瘀诸药联合组方，以清半夏、建泽泻、海藻消痰祛浊，丹参、郁金、山楂活血化瘀降脂，柴胡、郁金解郁疏肝畅气，生黄芪、炒白术健脾和胃祛湿，生大黄通腑祛脂降浊，众药合用，痰瘀并治、脾肝同调，切合病机，故能收效。SREBPs 家族蛋白是一类能与固醇调节元件发生特异性结合的蛋白，属于内质网膜连接蛋白，截止目前，发现有SREBP-1a、SREBP-1c 和SREBP2 共计3 种SREBPs。其中，与脂质代谢密切相关的为SREBP-1c。它具有调控脂肪细胞的分化和脂肪在细胞内异位积聚的作用，是一个重要的脂质合成的调节因子，在调控脂肪酸和三酰甘油合成中发挥着较为重要的作用。当动物体内脂质代谢紊乱，游离脂肪酸产生过多在内质网高度聚集时，会影响内质网膜的形态和结构，并激活C-Jun 氨基端激酶信号通路，导致胰岛素抵抗和内质网应激，从而激活SREBP-1c，使脂质合成加速、肝脏脂质沉积，导致肝脏脂肪变性［4-6］。资料表明，SREBP1c的过表达可导致脂质在肝脏和血管、胰岛等非脂肪组织的异常积聚，在NAFLD 的发病中起关键性作用［7］。

研究表明，脂代谢通路中某些关键的酶及相关基因的表达异常，致使脂质代谢紊乱，是引起肥胖、NAFLD的重要原因。其相关基因较多，而FAS 和ACC 是其中发挥作用不容忽视的两种酶，FAS 作为内源性脂肪酸合成的关键酶，通过调节脂质合成、促进能量消耗等方式维持机体能量的平衡［8］；ACC 则是脂肪合成的限速酶，与脂肪合成的速率密切相关。FAS 和ACC 是SREBP-1c 的下游因子，SREEP-1c 活化后可促进ACC、FAS、ACS 等成脂基因的转录，从而参与脂肪细胞分化、增殖及机体脂质代谢的病理生理调节［9］，也是研究NAFLD 形成过程中被关注的基础因素。

在本实验中，模型组大鼠SREBP-1c、FAS 和ACCm RNA 的表达水平较正常组异常增加，提示高脂饲料诱导了肝组织中SREBP-1c 的表达增多，高表达的SREBP-1c进而引起受其调控的下游参与脂肪合成的相关基因ACC、FAS 的活性增强，脂肪酸合成遂异常增多，血清TG、TC、FFA 含量明显增多。给予消痰化瘀中药干预后，高、中、低剂量组中，SREBP-1c、FAS 和ACCm RNA 的表达明显减少，血清和肝组织中TG、TC、FFA水平明显降低。说明消痰化瘀中药能够抑制SREBP-1c的表达、下调其靶基因FAS 和ACC，减少脂质合成和摄取、促进脂肪酸氧化，减轻肝细胞脂质沉积、改善肝脏脂肪变性，这可能是防治NAFLD 的分子机制之一。