实时可视化LAMP快速检测高危亚型HPV病毒方法的建立

俞焕腾,马 骉,2,方结红,林委,张明洲,2

(1．中国计量大学 生命科学学院,浙江 杭州 310018；2．浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

子宫颈癌是一种常见妇科恶性肿瘤,对女性健康造成很大影响[1]。在我国,宫颈癌的发病率快速上升,是发病率增长速度最快的癌症,居女性生殖系统肿瘤首位[2]。研究发现,高危亚型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是宫颈癌频发的主要原因。因此,检测宫颈细胞样本中HPV载量和基因型,已成为宫颈癌预判的一种常规诊断途径,为早期治疗方案的制定提供依据。

如今,传统培养法已经满足不了快速检测的要求,子宫颈癌的早期诊断需另辟新径[3]。随着分子生物学的发展,结合当下流行病学的研究现状,针对HPV病毒的临床诊断试剂种类较多。按照分子生物学的方法学原理,主要分为3类:荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)、基因芯片技术(gene chip technique)、第二代杂交捕获技术[4](Hybrid capture 2)。这些技术以高特异性、高灵敏度等优势,为病毒的快速筛查提供了支持。然而,相较于等温扩增方法,这些检测技术较大程度的依赖精密设备,不适用于现场快速诊断[5-6]。

作为一种高效恒温的核酸扩增技术,环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)利用独特的链置换循环,在60 ℃～65 ℃的恒温环境下,短时间内实现靶序列的大量扩增[7]。扩增产物的常规验证多由琼脂糖凝胶电泳和浊度检测等手段实现。为解决开盖污染等问题,在反应液中添加钙黄绿素等荧光染料,根据反应前后颜色的变化,实现可视化判读反应结果[8]。同时,结合半定量分析的检测要求,利用钙黄绿素染料(最大激发波长515 nm,最大吸收波长495 nm)与SYBR Green I染料最大荧光吸收(487 nm)/发射波长(520 nm)相近的特点,选择使用荧光定量PCR仪对反应过程进行实时监测[9]。

本研究选取临床诊断试剂市场上广泛应用的HPV反向杂交方法检测试剂盒,作为对照检测手段,方便进行实验数据的比对与校验。

1 材料与方法

1.1 材料

15种高危亚型HPV16(n=29), HPV18(n=26), HPV31(n=18), HPV33(n=22), HPV35(n=10), HPV39(n=9), HPV45(n=5), HPV51(n=15), HPV52(n=61), HPV56(n=14), HPV58(n=22), HPV59(n=8), HPV68(n=9), HPV73(n=2), HPV83(n=3)的阳性临床样本、非高危型阳性样本(n=132)和阴性临床样本(n=65)均由温州美众医学检验所惠赠。制备DH5α感受态细胞所用的大肠杆菌菌株由浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室保存与提供。LB Broth培养基,dNTPs,8U/μLBst2.0 DNA聚合酶,HPV反向杂交方法检测试剂盒,病毒基因组DNA快速提取试剂盒分别购自生工生物工程(上海)股份有限公司,美国Thermo Scientific公司,英国NEB公司,亚能生物技术(深圳)有限公司以及百泰克生物技术有限公司。

1.2 引物设计

根据人乳头瘤病毒的L1基因的高度保守的序列(GenBank登录号),HPV16(K02718),HPV18(AY262282), HPV31(J04353),HPV33(M12732),HPV35(M74117),HPV39(M62849),HPV45(X74479),HPV51(M62877),HPV52(X74481),HPV56(X74483),HPV58(D90400),HPV59(X77858),HPV68(X67161),HPV73(X94165),HPV83(AF151983)设计LAMP引物(表1)。LAMP引物利用Primer Explorer version 5.0在线软件设计,包括F3/B3(上/下游外引物)、FIP/BIP(上/下游内引物),部分含有LF/LB(上/下游环引物)。引物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。F3/B3引物组用于构建重组质粒。

表1 HPV高危亚型特异性LAMP引物组序列

续表1

1.3 病毒DNA模板提取

为了满足快速检测的要求,本研究采用试剂盒法,提取病毒基因组DNA。取200 μL含病毒的液体,根据百泰克病毒基因组DNA快速提取试剂盒操作手册进行基因组DNA提取,提取产物置于-20 ℃保存备用。

1.4 实时可视化LAMP分析方法的建立

将混匀的LAMP反应液置在65 ℃恒温条件下,每个等温循环设置为1 min,扩增60个循环后分析反应结果。一方面可以通过肉眼观察反应液颜色进行判断(荧光绿色为阳性,黄褐色为阴性),另一方面可借助荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96TM)的荧光曲线图进行半定量分析。

1.5 实时可视化LAMP方法的特异性和灵敏度

特异性:针对HPV病毒的15种高危亚型,采用已建立的实时可视化LAMP技术,扩增目的片段,观察有无交叉反应出现,以此来评价检测方法的特异性。

灵敏度:将阳性标准质粒定量,随后进行10倍梯度稀释,用于实时可视化LAMP检测,分析实时可视化LAMP方法的灵敏度。

1.6 实际样品检测

本研究中使用的宫颈组织样本,采集自女性妇科体检过程,包括宫颈分泌物和宫颈组织脱落细胞。温州美众医学检验所统一对样本进行灭活处理。使用实时可视化LAMP方法对样本基因组扩增,并与检验所的分析结果进行比较,对比并分析临床实际样本的总体检出率。

2 结果与分析

2.1 实时可视化LAMP体系优化

通过优化,实时可视化LAMP的最优反应体系如下:引物比为1∶8∶4(0.4 μmol/L外引物F3/B3,3.2 μmol/L内引物FIP/BIP,1.6 μmol/L环引物LF/LB),Tris-HCl(pH=8.8)终浓度为20 mmol/L,KCl终浓度为10 mmol/L,MgSO4终浓度为8 mmol/L,(NH4)2SO4终浓度为10 mmol/L,Tween 20终浓度为0.1%,Betaine终浓度为800 mmol/L,钙黄绿素终浓度为300 mmol/L,MnCl2终浓度为500 mmol/L,dNTPs终浓度为5.6 mmol/L,25 μL反应体系中加入Bst DNA聚合酶8U,DNA模板添加2.5 μL。

2.2 实时可视化LAMP特异性

10倍梯度稀释15个高危亚型的HPV病毒基因组DNA,其中用于特异性实验的模板DNA浓度大约为10 ng。以HPV58亚型为例(图1),观察各反应管颜色变化,结合扩增曲线进行数据分析。结果显示,并无交叉反应发生。另外,其他14个高危亚型实验过程中也并未发生非特异性扩增。

a:灵敏度实验扩增曲线,1—108copies/μL,2—107copies/μL,3—106copies/μL,4—105copies/μL,5—104copies/μL,6—103copies/μL,7—102copies/μL,8—101copies/μL,9—阴性对照；b.灵敏度实验实物；c.特异性实验扩增曲线;d.特异性实验实物.图1 HPV58亚型可视化LAMP反应Figure 1 The result of HPV 58 type for the LAMP assay

2.3 实时可视化LAMP灵敏度

使用灭菌水10倍梯度稀释后的15个HPV高危亚型病毒重组质粒,作为模板DNA进行灵敏度实验,并且各稀释梯度重复3次实验。实验结果如下:HPV68的检测限达105copies/μL;HPV18,56的检测限达104copies/μL;HPV31,39,45,52,58,83的检测限达103copies/μL;HPV35,51的检测限达102copies/μL;HPV16,33,59,73的检测限达101copies/μL。反应结束后,模板起始拷贝数的对数值为x轴,扩增起始时间为y轴,绘制标准曲线(表2)。

表2 高危HPV亚型LAMP实验标准曲线

Table 2 The standard curves of LAMP assay for high-risk HPV test

亚型标准曲线方程相关系数HPV16y=-1.544x+31.814R2=0.980HPV18y=-2.699x+44.794R2=0.987HPV31y=-2.475x+49.455R2=0.972HPV33y=-2.124x+43.698R2=0.971HPV35y=-2.916x+52.320R2=0.930HPV39y=-2.603x+44.539R2=0.976HPV45y=-3.457x+59.772R2=0.951HPV51y=-1.738x+31.473R2=0.958HPV52y=-7.440x+97.798R2=0.963HPV56y=-5.903x+94.250R2=0.954HPV58y=-1.761x+34.686R2=0.983HPV59y=-2.890x+46.488R2=0.974HPV68y=-11.469x+149.864R2=0.917HPV73y=-3.100x+50.339R2=0.970HPV83y=-7.333x+103.901R2=0.967

2.4 临床样本检测结果的比对分析

针对318例临床样本(132例非高危型阳性样本不计数),LAMP的阳性检出率达到79.56%(253/318),与检验所使用的反向杂交试剂盒检测结果持平(79.56%,253/318)。但是有14例临床样品检测结果不一致,比例达4.4%(14/318)。阳性检出率之间的差异,可能与LAMP检测手段针对某些高危亚型的高灵敏度有关。两种检测方法的符合率为91.20%,Kappa值为0.73(表3)。多亚型感染样本在整体统计分析中未做单独标识,是造成Kappa值偏低的主要原因[10]。

考虑到实验的准确性,我们分别对15组高危亚型(253例)的对比检测结果,进行了数据分析,统计结果详见表4。两种检测方法的匹配程度可以通过单一样本的Kappa值来判断。数据分析结果显示,15组Kappa值均大于0.85,表明两种检测方法针对单一高危亚型的匹配程度良好。由此可以推断,LAMP方法和反向杂交方法在高危亚型的检测上,其效率和准确性基本一致。

表3 高危亚型HPV临床样本的LAMP检测结果和反向杂交结果对比

注:反向杂交(reverse dot blot, RDB),置信区间(confidence interval, CI),高危亚型(high-risk HPV, HR-HPV),阳性结果(+),阴性结果(-)。

表4 LAMP方法和RDB方法的Kappa值及对比分析结果

3 讨 论

近年来,荧光定量PCR技术凭借高特异、高敏感、稳定、准确等优势已经广泛应用于病毒检测领域。该方法不仅可以进行定量分析,还能降低因污染造成的假阳性比率。然而,在基层地区的诊断市场中,该方法受到相对高成本的反应试剂和过于昂贵的仪器设备的影响,并不适合全覆盖式推广使用。本研究建立的实时可视化LAMP方法,不受上述因素的限制,判读反应结果仅需肉眼观察颜色变化,无须电泳鉴定。同时,由气溶胶引起的开盖易污染问题也得到了很好的解决[11-15]。作为筛选后的荧光指示剂,应用钙黄绿素染料不仅可以和荧光数据收集仪器实现无缝衔接,方便建立半定量分析的数据模型,而且可以在自然光线下,不借助任何读数仪器,通过肉眼观察染料颜色的变化,间接定性地判读实验结果。在本研究中,借助荧光定量PCR仪收集实验数据,不仅可以更直观的指导各反应参数的优化,还为半定量的LAMP方法的建立提供可靠依据,进而为今后深入探究LAMP定量分析方法奠定基础。但是灵敏度实验中反映出的各亚型间的差异性,可能与筛选引物组扩增效率有关,进一步优化反应体系,筛选获得高效的引物组,是提高敏感性的有效手段。本研究建立的实时可视化HPV-LAMP方法,除兼具高灵敏、高特异、高效率的特点外,摆脱了对精密仪器的依赖,降低了出现假阳性结果的概率,简便的操作更适用于偏远基层地区的现场快速检测,在商业和临床检测领域均具备较为广泛的应用前景。