天麻中总多酚的大孔树脂纯化工艺优化Δ

蔺蓓蓓，郑红星，刘祥，周天华，胡红忠，陈琛#（.陕西理工大学中德天然产物研究所/陕西省天麻山茱萸工程技术研究中心/陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 73000；.陕西百圣生物工程有限公司，陕西略阳 74300）

天麻（Gastrodia elata Bl.）又名赤箭、合离草、独摇芝等，为兰科天麻属多年生草本植物，属国家三级保护物种，主产于云南、四川、贵州等地，生长于林下阴湿、腐殖质较厚的土壤处[1]。天麻是一种名贵的中药材，其药用部位为块茎[2]，可用于治疗眩晕眼黑、头风头痛、肢体麻木、半身不遂、儿惊痫动风等病症[3]。天麻既为药用原料，又为食品原料，主要含有天麻素、对羟基苯甲醇以及多酚类等多种活性成分[4-5]。其中多酚类成分是植物在生长发育过程中的次生代谢产物[6]，具有抗氧化[7]、抗菌[8]、降血压[9]、抗衰老[10]、抗动脉粥样硬化[6]等多种药理活性。目前研究报道的多酚类成分的提取方法很多，如超声波法[11]、微波萃取法[6]、溶剂法[12]和水浴浸提法[13]等，但由于该类成分通常含有较多杂质，因此需要进一步分离纯化。

大孔树脂具有吸附能力强、稳定性好、使用周期长、选择性好、成本低等优点，已广泛应用于多酚类等天然产物的分离纯化[14-17]。鉴于此，本研究以天麻中总多酚粗提物为原料，以没食子酸为对照，采用福林酚比色法测定了天麻中总多酚的含量；通过比较4种不同极性大孔树脂对天麻中总多酚的静态吸附力和解吸力，对大孔树脂种类进行筛选；通过动态吸附-解吸试验，对天麻中总多酚的分离纯化工艺进行优化，以期为进一步开发利用天麻中总多酚、提高其药用价值提供参考。

1 材料

1.1 仪器

722G型紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；420R型冷冻离心机（北京四环科学仪器厂有限公司）；AL204型分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；RV10型旋转蒸发仪（德国IKA公司）；FW135/177型中草药粉碎机（上海台杏贸易有限公司）；YB-IA型真空恒温干燥箱（天津市拓普仪器有限公司）；HHS-4S型电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）；MAS-Ⅰ型微波提取仪（杭州宝赛生物科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

没食子酸对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号：G8720，纯度：≥98%）；D101型大孔树脂（安徽三星树脂科技有限公司，批号：MB2539）；AB-8型大孔树脂（批号：B0692）、ADS-7型大孔树脂（批号：KS34087）、D301型大孔树脂（批号：JD-63428）均购自天津波鸿树脂科技有限公司；福林酚试剂（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：BBM0548）；其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。4种型号大孔树脂物理参数详见表1。

表1 4种型号大孔树脂物理参数Tab 1 Physical parameters of 4 macroporous resins

1.3 药材

天麻药材采集于陕西省略阳县，经陕西理工大学生物科学与工程学院王勇教授鉴定为兰科天麻属植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的根茎。天麻药材经蒸煮后于45℃烘干，粉碎后过60目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 天麻中总多酚含量的测定

采用福林酚比色法测定天麻中总多酚的含量[18]。

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品25 mg，置于250 mL量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取药材样品粉末200 g，加80%乙醇3 000 mL，置于微波提取仪（温度：60℃，频率：600 Hz）提取10 min，浓缩并干燥，得浸膏。取浸膏20mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容，即得。

2.1.3 线性关系考察 取“2.1.1”项下对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，加水5 mL、福林酚试剂1.5 mL、10%Na2CO3溶液3 mL，再加水稀释至刻度，于30℃水浴放置30 min后，取出，摇匀，于760 nm波长处测定吸光度，以水作为空白对照。以没食子酸质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得没食子酸回归方程为y＝0.0474x－0.079 8（r＝0.999 9），表明没食子酸检测质量浓度的线性范围为4～32 μg/mL。

2.1.4 精密度试验 取“2.1.1”项下对照品溶液适量，于760 nm波长处连续测定6次。结果，吸光度的RSD为0.98%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、30、60、90、120、150 min时于760 nm波长处测定吸光度。结果，吸光度的RSD为0.98%（n＝6），表明供试品溶液于室温下放置150 min内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取样品适量，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于760 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算天麻中总多酚的含量。结果，天麻中总多酚的平均含量为0.257 mg/g，RSD为1.21%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 取已知含量的样品粉末，共6份，分别加入0.1 mg/mL对照品溶液10 μL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，于760 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

2.1.8 样品含量测定 取样品粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.3”项下方法显色后于760 nm波长处测定吸光度，按标准曲线法计算天麻中总多酚的含量，平行操作3次。结果，天麻中总多酚的含量为0.250～0.258 mg/g。

2.2 大孔树脂纯化工艺的优化

2.2.1 大孔树脂的预处理 取4种型号大孔树脂各50g，以水浸洗，然后用无水乙醇浸泡过夜。再以水浸泡清洗至无醇味（大约5倍树脂），然后用5%盐酸溶液浸泡（2倍大孔树脂体积）2 h，接着以水浸泡清洗至中性。最后用5%氢氧化钠溶液浸泡（2倍大孔树脂体积）2 h，然后以水浸泡清洗至中性[19]，于4℃保存，备用。

2.2.2 静态吸附率和静态解吸率的测定 ①分别称取“2.2.1”项下经预处理的4种型号大孔树脂各2 g，各3份分别置于具塞锥形瓶中，加“2.1.2”项下供试品溶液100mL，于28℃下以100 r/min振荡24 h，使树脂充分吸附后滤过；滤液按“2.1.3”项下方法显色后于760 nm波长处测定吸光度并计算4种型号大孔树脂的静态吸附量、静态吸附率。②用滤纸吸干充分吸附后的大孔树脂的表面滤液，置于干燥的具塞锥形瓶中，加80%乙醇50 mL，于28℃下以100 r/min振荡12 h使其充分解吸，解吸液滤过，滤液按“2.1.3”项下方法显色后于760 nm波长处测定吸光度并计算4种型号大孔树脂的静态解吸量、静态解吸率。静态吸附量＝（吸附前天麻中总多酚质量浓度－吸附后天麻中总多酚质量浓度）×上样液体积/干树脂质量。静态吸附率＝[（吸附前天麻中总多酚质量浓度－吸附后天麻中总多酚质量浓度）/吸附前天麻中总多酚质量浓度]×100%。静态解吸量＝洗脱液中样品质量浓度×洗脱液体积/干树脂质量。静态解吸率＝[洗脱液中样品质量浓度×洗脱液体积/（吸附前天麻中总多酚质量浓度－吸附后天麻中总多酚质量浓度）]×上样液体积×100%。4种型号大孔树脂的静态吸附及静态解吸结果见表3、图1。

表3 4种型号大孔树脂的静态吸附及静态解吸结果（±s，n＝3）Tab 3 Results of static adsorption-desorption of four macroporous resins（±s，n＝3）

表3 4种型号大孔树脂的静态吸附及静态解吸结果（±s，n＝3）Tab 3 Results of static adsorption-desorption of four macroporous resins（±s，n＝3）

型号AB-8型ADS-7型D101型D301型静态吸附量，mg/g 0.036±0.001 0.055±0.001 0.034±0.002 0.057±0.002静态吸附率，%36.00±1.32 56.50±0.87 33.50±1.50 54.70±1.66静态解吸量，mg/g 0.017±0.006 0.030±0.002 0.011±0.001 0.035±0.002静态解吸率，%86.07±0.80 45.97±1.11 75.10±1.18 69.97±1.80

图1 4种型号大孔树脂的静态吸附及静态解吸结果柱状图Fig 1 Static adsorption and desorption column diagram of four macroporous resins

由表3、图1可知，ADS-7型大孔树脂的静态吸附率较高，而静态解吸率最低；AB-8、D101型大孔树脂的静态解吸率较高，而静态吸附率较低；D301型大孔树脂的静态吸附率和解吸率均较高。综合考虑，选择D301型大孔树脂进行进一步考察。

2.2.3 动态吸附性能考察 ①上样液流速考察：取“2.2.1”项下经预处理的D301型大孔树脂15 g湿法装柱，另取“2.1.2”项下供试品溶液3倍柱体积（BV）（质量浓度4 mg/mL，以天麻中总多酚质量计，下同），各3份，以流速2、3、4 BV/h进行吸附试验，收集流出液；静置2 h后以100 r/min振摇10 h，充分吸附后，按“2.1.3”项下方法显色并于760 nm波长处测定吸光度，参照“2.2.2”项下公式计算动态吸附量和动态吸附率，结果见表4。

由表4可见，随着上样液流速的加快，动态吸附量、动态吸附率均逐渐下降；当上样液流速为2 BV/h时，动态吸附量、动态吸附率均为最高。可能与上样液流速过快导致上样液在层析柱中停留的时间较短，不能与树脂充分接触，导致树脂吸附效果不明显[20-21]有关。为减少实际生产成本，本研究选择上样液流速为2 BV/h。

表4 不同上样液流速比较（n＝3）Fig 4 Comparison of different flow rate of sampling solution（n＝3）

②上样液质量浓度考察：取“2.2.1”项下经预处理的D301型大孔树脂15 g湿法装柱，另取按“2.1.2”项下方法制备的质量浓度分别为1、2、3、4、5 mg/mL的供试品溶液，各3份，以上样液流速2 BV/h、上样量3 BV进行吸附试验，收集流出液；静置2 h后以100 r/min振摇10 h，充分吸附后，按“2.1.3”项下方法显色并于760 nm波长处测定吸光度，参照“2.2.2”项下公式计算动态吸附量和动态吸附率，结果见表5。

表5 不同上样液质量浓度比较（n＝3）Fig 5 Comparison of different mass concentration of sampling solution（n＝3）

由表5可见，随着上样液质量浓度的增加，动态吸附量、动态吸附率均呈先增加后降低的趋势；当上样液质量浓度为4 mg/mL时，动态吸附量、动态吸附率均最高。其原因可能为上样液质量浓度过大，纯化时间较长，树脂不能将天麻中总多酚完全吸收，从而导致吸附能力降低。故本研究选择上样液质量浓度为4 mg/mL。

2.2.4 动态解吸性能考察 ①洗脱溶剂体积分数考察：取“2.2.1”项下经预处理的D301型大孔树脂15 g湿法装柱，另取“2.1.2”项下供试品溶液3 BV，各4份，以上样液流速2 BV/h，上样液质量浓度4 mg/mL进行吸附试验，收集流出液。静置2 h后，分别用50%、60%、70%、80%、90%乙醇以5 BV进行洗脱，流速为3 BV/h，收集流出液，按“2.1.3”项下方法显色后，于760 nm波长处测定吸光度并参照“2.2.2”项下公式计算动态解吸量和动态解吸率，结果见表6。

表6 不同洗脱溶剂体积分数比较（n＝3）Tab 6 Comparison of different volume fraction of eluent（n＝3）

由表6可见，随着乙醇体积分数的增加，动态解吸量、动态解吸率均呈先增加后降低的趋势；当乙醇体积分数为70%时，动态解吸量、动态解吸率均最高。其原因可能为70%乙醇更有利于天麻中总多酚的溶解，增加乙醇体积分数可能会影响天麻中总多酚和大孔树脂之间的相互作用[22]。故本研究选择洗脱溶剂为70%乙醇。

②洗脱流速考察：取“2.2.1”项下经预处理的D301型大孔树脂15 g湿法装柱，另取“2.1.2”项下供试品溶液3 BV，以上样液流速2 BV/h，上样液质量浓度4 mg/mL进行吸附试验，收集流出液。静置2 h后，用70%乙醇以5 BV进行洗脱，洗脱流速分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5 BV/h，收集流出液，按“2.1.3”项下方法显色后，于760 nm波长处测定吸光度并参照“2.2.2”项下公式计算动态解吸量和动态解吸率，结果见表7。

表7 不同洗脱流速比较（n＝3）Tab 7Comparison of different flow rates of eluent（n＝3）

由表7可见，随着洗脱流速的增加，动态解吸量、动态解吸率均呈先增加后降低的趋势；当洗脱流速为3 BV/h时，动态解吸量、动态解吸率均为最高。其原因可能为解吸液通过层析柱速度过快，使解吸液不能与树脂充分接触，从而影响解吸液对天麻中总多酚的溶解。故本研究选择洗脱流速为3 BV/h。

③洗脱溶剂体积考察：取“2.2.1”项下经预处理的D301型大孔树脂15 g湿法装柱，另取“2.1.2”项下供试品溶液3 BV，以上样液流速2 BV/h，上样液质量浓度4 mg/mL进行吸附试验，收集流出液。静置2 h后，用70%乙醇以洗脱流速3 BV/h进行洗脱试验，洗脱溶剂分别为3、4、5、6、7、8 BV，收集流出液，按“2.1.3”项下方法显色后，于760 nm波长处测定吸光度并参照“2.2.2”项下公式计算动态解吸量和动态解吸率，结果见表8。

表8 不同洗脱溶剂体积比较（n＝3）Tab 8Comparison of different volume of eluent（n＝3）

由表8可见，随着洗脱溶剂体积的增加，动态解吸量、动态解吸率均呈先增加后降低的趋势；当洗脱溶剂体积为5 BV时，动态解吸量、动态解吸率均最高。其原因可能为随着洗脱溶剂体积的增加，天麻中总多酚被充分洗脱，此时再增加洗脱溶剂体积，解吸能力下降，在实际生产中可能会增加生产成本[23]。故本研究选择洗脱液体积为5 BV。

综合上述试验结果，最优纯化工艺为上样液流速2 BV/h、上样液质量浓度4 mg/mL、洗脱溶剂（乙醇）体积分数70%、洗脱流速3 BV/h、洗脱溶剂体积5 BV。经验证，此时天麻中总多酚平均含量为0.381 mg/g（n＝3）。

3 讨论

大孔树脂是一类不含交换基团且带有孔状结构的高分子吸附树脂，是具有浓缩、分离作用的高分子聚合物，已广泛应用于多酚、多糖和生物碱等天然产物的分离、纯化，目前采用大孔树脂纯化的有龙岗总多酚[24]、生姜多酚[15]、刺山柑总酚酸[25]、山葡萄籽多酚[26]等，这都提示了大孔树脂精制植食性植物多酚类有效成分的可行性。

本研究采用福林酚比色法测定了天麻中总多酚的含量，该方法灵敏度高、稳定性好。天麻中总多酚在D301型中极性大孔树脂中的吸附和解吸能力相对较好，最优纯化工艺为上样液流速2 BV/h、上样液质量浓度4 mg/mL、洗脱溶剂（乙醇）体积分数70%、洗脱流速3 BV/h、洗脱溶剂体积5 BV。纯化后天麻中总多酚的解吸率为69.97%，天麻中总多酚含量为0.381 mg/g。

综上所述，本研究所建含量测定方法灵敏度高、稳定性好；优化的纯化工艺稳定、可行。