基线等比增减设计法优选黄芪注射液联合灯盏细辛注射液抗大鼠脑缺血再灌注损伤的最佳配比Δ

2019-08-13田枫李佶操唐绍微孙雨诗林诗佳张芳艳谢兴亮盛艳梅成都医学院药学院成都610500

中国药房 2019年14期

田枫，李佶操，唐绍微，孙雨诗，林诗佳，张芳艳，谢兴亮，盛艳梅（成都医学院药学院，成都610500）

脑缺血又称“中风”，是由多种原因引发的脑局部血流量突然中断或减少，导致相应脑组织出现短暂性缺血，造成继发性自主神经功能障碍的一种病理状态。中医临床在益气活血法治疗原则的指导下，将黄芪注射液和灯盏细辛注射液联合用以治疗脑缺血疾病，效果较好，且联用效果优于任一制剂单用或者常规西医治疗，但相关研究并未明确二者的最佳配比（文献报道黄芪注射液-灯盏细辛注射液的剂量配比范围为2∶3～5∶2）[1-3]。为此，本研究拟以改良线栓法复制大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注损伤大鼠模型，并运用基线等比增减设计法初步探讨两药联用抗大鼠脑缺血再灌注损伤的最佳配比，以期为脑缺血疾病的临床合理用药提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

Powerwave XS2型酶标仪（香港基因有限公司）；BSA124S-CW型千分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；LD5-2A型台式低速离心机（北京医用离心机厂）；HH-Z型水浴锅（上海常思工贸有限公司）。

1.2 药品与试剂

黄芪注射液[黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，批号：A20150409，规格：每支装10 mL（相当于原药材20 g）]；灯盏细辛注射液（云南生物谷药业股份有限公司，批号：20150346，规格：10 mL）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（上海灵锦精细化工厂有限公司，批号：20150103）；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：20150501）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号均为20160515）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 动物

SPF级健康SD大鼠，雄性，7～8周龄，体质量250～300 g，由四川省医学科学院/四川省人民医院实验动物研究所提供，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-15。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和给药组，每组8只。除假手术组外，其余各组大鼠均采用改良线栓法[4]复制MACO再灌注损伤模型。称定大鼠质量后，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，于颈部正中切口，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），将CCA近心端用缝合线打一活结，分离并结扎翼鄂动脉，在ECA上距分叉1 cm处剪一小口，将ECA与ICA拉成一条直线，将备好的线栓经分叉处插入ICA，插入深度约20 mm以阻断大脑中动脉（MCA），留长约2 mm的线栓于皮肤外。阻断大鼠MCA 2 h后（即大鼠开始有意识），抽出长约10 mm的线栓，剪去位于皮肤外的线栓，进行再灌注。待大鼠苏醒后，观察其运动状态，按Longa评分法（评分标准[4]见表1）对其进行神经功能缺损评分（若评分为＞1～3分，表明模型复制成功）。假手术组大鼠不剪开血管，仅在各绑线处绑线，其余操作同上。造模成功后，各给药组大鼠均腹腔注射相应药物（给药剂量参考临床实际用量，以注射液体积计；采用基线等比增减法设置黄芪注射液-灯盏细辛注射液6个剂量配比组，即0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、10∶0，分别以A、B、C、D、E、F表示；其中，A组为灯盏细辛注射液单用组，F组为黄芪注射液单用组），即时给药1次，随后24 h再给药1次，单次给药剂量均为2 mL/（kg·d），两种注射液的给药间隔为30 min；假手术组和模型组大鼠均腹腔注射等体积生理盐水。

表1 Longa（0～4分）评分标准Tab 1 Longa scoring criteria（0-4 point）

2.2 评价指标

2.2.1 神经行为学评分再灌注后48 h（即末次给药后24 h）后，采用Longa评分法对各组大鼠进行神经功能缺损评分。

2.2.2 血清氧化应激指标检测评分完成后，立即采集各组大鼠股动脉血适量，3 000 r/min离心10 min，分离血清，采用比色法以酶标仪检测各组大鼠血清MDA含量以及SOD活性。严格按照相应试剂盒说明书方法操作。

2.2.3 脑梗死率测定取血后处死各组大鼠，立即取脑，于－20℃冰箱中速冻15 min后，去除嗅球和脑干部分，行连续冠状切片，共5片（厚度约2 mm），经TTC染色后，观察各切片的梗死情况（梗死区域为白色，正常区域为红色）；分别称定梗死组织和脑组织质量，计算大鼠脑梗死率[脑梗死率＝（梗死组织质量/脑组织质量）×100%]。

2.2.4 药效配伍强度评价计算各给药组大鼠神经功能缺损评分降低率和脑梗死率降低率，神经功能缺损评分降低率＝[（模型组评分－给药组评分）/模型组评分]×100%]，脑梗死率降低率＝[（模型组脑梗死率－给药组梗死率）/模型组脑梗死率]×100%；参照金氏公式[5]计算增效指数（q），q＝甲/（乙+丙－乙×丙）（式中，“甲”表示联用组大鼠相应指标的降低率，“乙”表示黄芪单用组大鼠相应指标的降低率，“丙”表示灯盏细辛单用组大鼠相应指标的降低率）；根据q值判断药物在配伍联用后的治疗效果是否优于单独给药：当q＞1.15时，表示两药合用有协同作用；当0.85＜q＜1.15时，表示两药合用有相加作用；当q＜0.85时，表示两药合用有拮抗作用。

2.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，A、B、C、D、E组大鼠神经功能缺损评分均显著降低，且C组显著低于A、F组（即单用组），差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；B、C、D、E组（即联用组）的q值分别为0.90、1.30、1.00、0.70，仅C组的q值＞1.15，详见表2。

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of neurological impairment scores of rats in each group（±s，n＝8）

注：与假手术组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与F组比较，ΔP＜0.05；与A组比较，□P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.group F，ΔP＜0.05；vs.group A，□P＜0.05

组别假手术组模型组A组B组C组D组E组F组黄芪注射液剂量，mL/kg灯盏细辛注射液剂量，mL/kg神经功能缺损评分降低率，%q值0 0 0 0 0 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0神经功能缺损评分，分0.1.75±0.83＊＊0.88±0.58#0.63±0.48##0.13±0.33##Δ□0.50±0.50##0.88±0.60#1.00±0.70 49.7 64.0 92.6 71.4 49.7 42.9 0.90 1.30 1.00 0.70

3.2 各组大鼠血清MDA含量以及SOD活性比较

与假手术组比较，模型组大鼠血清MDA含量显著升高，SOD活性显著减弱，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，A、B、C、D、E组大鼠血清MDA含量均显著降低，且B、C、D、E组均显著低于F组；A、B、C、D、E组大鼠血清SOD活性均显著增强，且C组显著强于F组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），详见表3。

表3 各组大鼠血清MDA含量以及SOD活性比较（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of serum contents of MDA and activities of SOD of rats in each group（±s，n＝8）

注：与假手术组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与F组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.group F，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

SOD，U/mL 180.94±25.37 118.33±9.28＊＊138.86±9.47##139.26±9.93##148.56±7.74##Δ 136.98±10.19#138.02±13.67#131.66±12.63组别假手术组模型组A组B组C组D组E组F组黄芪注射液剂量，mL/kg灯盏细辛注射液剂量，mL/kg 0 0 0 0 0 0.40 0.80 1.20 1.60 2.00 2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0 MDA，nmol/mL 5.20±2.50 10.90±2.38＊＊7.99±0.93##7.71±0.96##Δ 6.92±1.33##Δ 7.17±0.32##ΔΔ 8.32±1.18##Δ 10.04±0.84

3.3 各组大鼠脑梗死率比较

与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死区域明显增大，其脑梗死率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠脑组织梗死区域均有不同程度地缩小，其中B、C、D、E组大鼠脑梗死率均显著降低，且C、D组显著低于F组，C组显著低于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；B、C、D、E组的q值分别为0.79、1.27、0.98、0.82，仅C组的q值＞1.15，详见图1、表4。

4 讨论

脑缺血是一类常见的脑部血管疾病，属于心脑血管疾病范畴。根据世界卫生组织（WHO）报告显示，2015年全球有1 770万人死于心脑血管疾病，占死亡总数的31.0%，其中死于中风的人数约占心脑血管疾病死亡总数的37.9%[6]。在2016年全球5 690万例死亡者中，缺血性心脏病和中风共造成1 520万人死亡，约占死亡总数的26.7%[7]。脑缺血疾病在过去15年中一直是全球患者死亡的主要原因之一，具有发病率、病死率、致残率和复发率均高等特点[8-9]。

图1 各组大鼠脑梗死区观察图Fig 1 Observation charts of cerebral infarction area of rats in each group

表4 各组大鼠脑梗死率比较（±s，n＝8）Tab 4 Comparison of cerebral infarction rates of rats in each group（±s，n＝8）

注：与假手术组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与F组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与A组比较，□P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.group F，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；vs.group A，□P＜0.05

组别假手术组模型组A组B组C组D组E组F组黄芪注射液剂量，mL/kg 0.0.0.0.40 0.80 1.20 1.60 2.00灯盏细辛注射液剂量，mL/kg 0.0.2.00 1.60 1.20 0.80 0.40 0.脑梗死率，%0 23.95±9.26＊＊16.43±5.35 14.23±6.50#8.29±1.22##ΔΔ□11.86±3.11##Δ 13.86±3.73#17.00±3.49脑梗死率降低率，%q值31.4 40.6 65.4 50.5 42.1 29.0 0.79 1.27 0.98 0.82

目前，西医临床治疗脑缺血疾病主要着眼于扩张脑血管、改善微循环等方面，但其只能暂时缓解患者的临床症状，总有效率低，且长期用药不良反应明显，不利于患者预后[10]。而在中医辨证论治整体思想的指导下配伍组方，往往可通过多层次、多途径、多靶点综合作用于脑缺血疾病的多个病理环节，从而在整体上有效减轻患者脑缺血再灌注损伤[11-12]。黄芪注射液是益气药黄芪经提取制备而成的黄色澄明液体，具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉等功效；灯盏细辛注射液则是由活血药灯盏细辛中酚酸类成分制成的灭菌水溶液，具有活血祛瘀、通络止痛等功效，两药联用符合中医益气活血疗法的主要原则，临床实践证实其联用治疗缺血性疾病的效果较好[1-3]。为进一步明确两药的最佳配比，本研究以MCAO再灌注损伤模型大鼠为对象，初步考察了两药不同配比对大鼠相关指标的影响。

鉴于脑缺血后脑微循环紊乱引起脑组织中氧自由基生成加剧，导致一系列氧化反应，从而引起神经细胞损伤，进而导致其神经行为发生改变[13]，故本研究选择神经功能缺损评分、脑梗死率以及MDA、SOD等指标初步评价药物对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用。其中，MDA是细胞膜脂质过氧化最重要的产物之一，通过MDA含量可初步评价其脂质过氧化的程度；SOD是生物体内氧自由基的天然清除剂，可将体内的超氧化自由基进行转化并予以清除[14]。本研究采用基线等比增减设计法，在已有文献[15]的基础上，探讨了黄芪注射液与灯盏细辛注射液不同配比联用对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的治疗作用，发现两药联用能不同程度地缩小大鼠的脑梗死区域，显著降低其神经功能缺损评分、脑梗死率和血清MDA含量，显著升高其血清SOD活性，提示两药联用能减少脑缺血再灌注所引起的应激性脑损伤。同时本研究结果还显示，C组大鼠的神经缺损评分显著低于A、F组，B、C、D、E组的q值分别为0.90、1.30、1.00、0.70；C、D组大鼠的脑梗死率均显著低于F组，C组显著低于A组，B、C、D、E组的q值分别为0.79、1.27、0.98、0.82；C组的q值均大于1.15，提示两药联用的效果优于单用，且当黄芪注射液-灯盏细辛注射液的剂量比为4∶6时，两药具有协同增效作用。

综上所述，以不同比例配伍的益气药黄芪注射液和活血药灯盏细辛注射液对脑缺血再灌注损伤模型大鼠均有一定的保护作用，可缓解其神经功能缺损，减轻氧化应激，并缩小其脑梗死区域；两药联用的效果优于单用，且其最佳配比为4∶6，本研究可为中药治疗脑缺血疾病提供参考。本课题组后续将进一步采用病证结合模型对本结论进行验证，并探讨益气活血法对气虚血瘀型缺血性脑卒中模型大鼠脑神经保护作用的具体机制。