二氮嗪对氧化损伤状态下软骨细胞增殖和凋亡的影响机制研究Δ

蒋翠云，任少琳，张纯萍，程少文（.海南医学院第一附属医院药学部，海口57002；2.海南医学院第一附属医院创伤医学中心，海口 57002）

关节软骨是保障关节运动的最主要结构，软骨细胞位于软骨组织表层，可随着关节内微环境的变化而相应地合成和分泌基质与纤维[1]。有研究发现，在关节软骨退变的过程中，软骨细胞的增殖活力减弱、凋亡增多[2]。软骨细胞的凋亡途径主要包括线粒体途径、内质网应激（ERS）途径等[3]。有研究证实，抑制ERS途径可减少软骨基质中聚蛋白多糖酶和Ⅱ型胶原蛋白（Coll-Ⅱ）的表达，使软骨细胞增殖活力增强、凋亡减少[4]。因此，抑制ERS途径可使软骨细胞恢复正常的增殖和凋亡状态，保护软骨细胞，减少关节软骨缺失，对防治骨关节炎（OA）等关节软骨退行性疾病有重要意义。二氮嗪是一种钾离子通道激活剂，具有松弛血管平滑肌、降低血压、抑制胰岛素分泌的作用，临床上主要用于高血压危象急救及低血糖症等的治疗[5]。有研究表明，二氮嗪可通过抑制ERS途径来促进骨骼肌成肌细胞的增殖并抑制其凋亡[6]。但目前尚未见二氮嗪对氧化损伤状态下软骨细胞增殖活力及凋亡的影响机制研究。因此，本研究从ERS途径探讨二氮嗪对氧化损伤状态下软骨细胞增殖活力及凋亡影响的作用机制，旨在为该药防治关节软骨退行性病变的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

BSA124S/BSA124S-CW型分析天平（苏州金钻称重设备系统开发有限公司）；64R型低温高速离心机（北京时代北利离心机有限公司）；FYL-YS-50L型恒温培养箱（美国Godinier公司）；ELx800NB型酶标仪（美国BioTek公司）；Attune NxT型流式细胞仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-24F型电泳仪（绍兴上虞艾科仪器设备有限公司）；ChemiDocXRS+型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药品与试剂

二氮嗪（批号：022K1516，纯度：98%）、30%过氧化氢（H2O2）溶液均购自美国Sigma公司；胰酶（济南维尔康生化制药有限公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Worthington公司）；DMEM培养基（美国Hyclone公司）；CCK-8检测试剂盒（上海锐赛生物技术有限公司）；Bin-ding buffer溶液（北京拜尔迪生物技术有限公司）；AnnexinⅤ-PE细胞凋亡检测试剂盒（上海继锦化学科技有限公司）；BCA蛋白定量检测试剂盒（武汉华瑞康生物科技有限公司）；细胞裂解液（北京华夏远洋科技有限公司）；兔抗人胱天蛋白酶3（Caspase-3）单克隆抗体（上海沪宇生物科技有限公司）；兔抗人Bcl-2相关X蛋白（Bax）单克隆抗体（上海麦仓生物医药科技有限公司）；兔抗人增强子结合蛋白环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）单克隆抗体（上海美恩生物技术有限公司）；兔抗人甘油三磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司）；过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）；ECL电化学发光试剂盒（上海炎熙生物科技有限公司）；pH 7.5磷酸盐缓冲液（PBS，上海田源生物技术有限公司）；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

1.3 动物

SPF级SD小鼠3只，雌性，1周龄，体质量为（20±2）g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。

2 方法

2.1 小鼠软骨细胞的分离与培养

取3只小鼠，对其膝关节作无菌处理后摘取膝关节软骨，用眼科剪剪成絮状，PBS冲洗，胰酶消化0.5 h，Ⅱ型胶原酶消化2 h。取上清液，以2 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入DMEM培养基10 mL重悬细胞后，按1×106个/皿接种于培养皿。将培养皿置于37℃、5%CO2恒温箱内孵育，每72 h换液1次，当细胞生长密度达95%以上时进行消化、传代，取第3代细胞进行后续试验。

2.2 分组与给药

参考文献[6]的给药剂量和作用时间进行分组、给药。取第3代软骨细胞，随机分为对照组、损伤模型组和二氮嗪组，按1×106个/cm2的密度接种于6孔细胞培养板上。对照组细胞不作处理；损伤模型组细胞加入300 μmol/L的H2O2溶液100 μL后，在37 ℃、5%CO2恒温箱内孵育8 h；二氮嗪组细胞加入300 μmol/L的二氮嗪溶液（以0.4%二甲基亚砜溶液为溶剂配制）100 μL，在37℃、5%CO2恒温箱内孵育0.5 h进行预处理后，再加入300 μmol/L H2O2溶液100 μL，与损伤模型组同法孵育8 h。

2.3 软骨细胞增殖活力检测

采用CCK-8法检测。取第3代软骨细胞，按“2.2”项下方法分组、给药并孵育完毕后，吸弃上清液，每孔加入10%CCK-8溶液100 μL，于37 ℃、5%CO2恒温箱孵育4 h，采用酶标仪于450 nm波长下测定光密度（OD值）。试验重复3次后取均值。按公式计算细胞增殖活力：细胞增殖活力＝（损伤模型组或二氮嗪组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

2.4 软骨细胞凋亡率检测

采用流式细胞术检测。取第3代软骨细胞，按“2.2”项下方法分组、给药并孵育完毕后，以2 000 r/min离心5 min，弃上清，胰酶消化细胞。收集贴壁软骨细胞，加入Binding buffer溶液500 μL重悬细胞，然后加入Annexin V-PE试剂1 μL，混匀，于25℃下避光反应10 min，在1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。试验重复3次后取均值。

2.5 软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达量检测

采用Western blotting法检测。取第3代软骨细胞，按“2.2”项下方法分组、给药并孵育完毕后，加细胞裂解液，匀浆，12 000 r/min离心8 min；取上清液，以BCA试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白上样，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；将膜在5%脱脂奶粉常温封闭2 h，分别加入Caspase-3单克隆抗体（1∶200）、Bax单克隆抗体（1∶100）、CHOP单克隆抗体（1∶300）后，均与内参GAPDH单克隆抗体（1∶100）混合，4℃下孵育过夜；PBS冲洗膜，加入二抗（1∶500），37℃孵育1 h；PBS冲洗，ECL显色、显影。采用凝胶成像仪扫描，以Image Quant TL软件分析各目标蛋白条带的灰度值与内参蛋白条带灰度值之比（即相对灰度值），用来表示目标蛋白表达量。试验重复3次后取均值。

2.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组软骨细胞增殖活力比较

与对照组比较，损伤模型组软骨细胞增殖活力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与损伤模型组比较，二氮嗪组软骨细胞增殖活力显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 各组软骨细胞的增殖活力和凋亡率（±s，n＝3）Tab 1 Proliferation activity and apoptotic rate of chondrocyte in each group（±s，n＝3）

表1 各组软骨细胞的增殖活力和凋亡率（±s，n＝3）Tab 1 Proliferation activity and apoptotic rate of chondrocyte in each group（±s，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与损伤模型组比较，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05；vs.injury model group，#P＜0.05

凋亡率，%32.45±1.67 75.68±2.05＊46.59±2.25#组别对照组损伤模型组二氮嗪组增殖活力，%100.00±0.00 41.29±3.02＊67.35±2.68#

3.2 各组软骨细胞凋亡率比较

与对照组比较，损伤模型组软骨细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与损伤模型组比较，二氮嗪组软骨细胞凋亡率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见图1、表1。

图1 各组软骨细胞凋亡率流式细胞图Fig 1 Flow cytograms of apoptotic rate of chondrocyte in each group

3.3 各组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP的蛋白表达量比较

与对照组比较，损伤模型组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达量均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与损伤模型组比较，二氮嗪组软骨细胞中上述蛋白表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），详见图2、表2。

图2 各组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达电泳图Fig 2 Electrophoretograms of protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group

表2 各组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达量（±s，n＝3）Tab 2 Protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group（±s，n＝3）

表2 各组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达量（±s，n＝3）Tab 2 Protein expression of Caspase-3，Bax and CHOP in chondrocyte in each group（±s，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与损伤模型组比较，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05；vs.injury model group，#P＜0.05

组别对照组损伤模型组二氮嗪组CHOP 1.04±0.02 2.62±0.22＊1.73±0.18#Caspase-3 1.03±0.03 2.41±0.23＊1.50±0.16#Bax 1.05±0.02 1.82±0.19＊1.44±0.09#

4 讨论

OA是以关节基质破坏及关节软骨细胞减少为主要病理特点的退行性关节疾病，而关节软骨是由致密结缔组织的胶原纤维构成的透明软骨，软骨细胞是关节软骨中的唯一细胞成分，存在于无血管、神经或淋巴管分布的特殊微环境中，其既能合成蛋白多糖、Coll-Ⅱ等基质大分子物质，又能降解衰老退变的软骨基质，还参与维持软骨组织平衡[7]。有研究发现，软骨细胞发生氧化损伤后较正常软骨细胞在体外的增殖活力明显减弱、凋亡明显增多[8]。有研究显示，H2O2可诱导骨骼肌成肌细胞凋亡，可作为氧化损伤造模试剂[9]。本研究通过H2O2诱导软骨细胞发生氧化损伤后发现，在氧化损伤状态下的软骨细胞增殖活力显著下降，凋亡率显著升高。

软骨细胞大量凋亡主要表现为内质网、高尔基体、溶酶体的增加以及自噬性空泡形成[10]。内质网是一种具有分泌功能的细胞器，也是蛋白质合成和细胞内信号转导的重要场所，在ERS过程中发挥着重要作用[11]。ERS包括缺糖损伤、未折叠蛋白增加、钙离子流失及自由基释放过多等，这些刺激因素均可导致内质网腔内钙离子平衡紊乱、未折叠蛋白聚集等，进而激活内质网超负荷反应，使细胞增殖活性减弱、凋亡增强，造成关节软骨大量缺失，最终导致关节软骨退行性病变[12]。Caspase-3、Bax、CHOP为ERS途径相关蛋白。Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键分子，在某些细胞凋亡末期的细胞裂解及凋亡小体形成过程中扮演重要角色，可激活下游的细胞凋亡蛋白酶[13]。Bax是重要的促细胞凋亡基因之一，其编码产物可通过与B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）家族中的凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-xL的表达产物结合，替换Bcl-xL/Bax、Bcl-2/Bax二聚体中的Bax，而达到促进细胞凋亡的目的[14]。CHOP基因受蛋白激酶R样内质网激酶等通路调控，是ERS诱导软骨细胞凋亡的重要因素[15]。本研究通过Western blotting法检测发现，损伤模型组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达量均较对照组显著升高，表明软骨细胞发生氧化损伤后其ERS作用增强，导致上述蛋白表达上调。

有研究显示，二氮嗪可通过抑制死亡受体和线粒体途径改善抗谷氨酸盐、β-淀粉样蛋白等诱导的神经细胞损伤[16-17]；其可通过阻碍ERS途径抑制H2O2诱导的骨骼肌成肌细胞凋亡[5]。本研究结果显示，二氮嗪组软骨细胞增殖活力较损伤模型组显著升高，凋亡率则显著降低，表明二氮嗪可有效抑制氧化损伤诱导的软骨细胞凋亡，提高软骨细胞增殖活力。Western blotting检测结果显示，二氮嗪组软骨细胞中Caspase-3、Bax、CHOP蛋白表达量均较损伤模型组显著降低，提示二氮嗪可通过下调软骨细胞中的上述蛋白来抑制ERS，恢复内质网功能，稳定细胞内环境，避免氧化损伤诱导的软骨细胞活力下降及过度凋亡，从而预防关节软骨退行性病变的发生。这与已有研究结果相符。

综上所述，二氮嗪可能通过抑制ERS途径，提高软骨细胞在氧化损伤状态下的增殖活力，并抑制软骨细胞凋亡，这可为防治关节软骨退行性病变提供新的治疗思路与方向，具有重要的临床意义。但二氮嗪是否通过其他机制对氧化损伤状态下的软骨细胞的增殖及凋亡产生影响尚不清楚，仍需进一步研究。