转谷氨酰胺酶3(TGM3)促进肝细胞肝癌(HCC)增殖侵袭的潜在机制及其临床意义

羊樟福 胡 博 付佩尧 喻敏成 徐 泱

(复旦大学附属中山医院肝肿瘤外科-复旦大学肝癌研究所 上海 200032)

原发性肝癌恶性程度高,在全世界常见恶性肿瘤中发病率排第6位,死亡率居第2位,其中约有一半的新发病例和死亡病例发生在我国[1]。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最常见的类型,约占90%[2]。近年来,尽管在HCC早诊、早治方面已取得巨大进步,但患者总体预后仍较差[3-5]。由于起病隐匿,超过60%的HCC患者在首次就诊时已处于中晚期,因此错失手术机会。接受根治性切除术的患者术后1年复发率高达19%～25%,5年复发率超过70%[6-11]。因此,研究HCC发生、发展规律,探寻新的预后指标和治疗靶点来提高临床治疗效果意义重大。

转谷氨酰胺酶家族(transglutaminases,TGMs)是一类结构和功能相关性蛋白,主要以钙离子依赖性方式催化蛋白质谷氨酸残基与赖氨酸残基形成共价交联来完成特定蛋白的翻译和修饰,目前已在人体中发现9种转谷氨酰胺酶亚型[12-13],其中包括TGM3。TGM3广泛表达于小肠、脑、皮肤和毛囊,在角质化细胞套膜骨架形成及毛发的生成中起重要作用[14]。TGM3表达异常与多种肿瘤发生相关,包括喉癌[15]、食管鳞状细胞癌[16]、口腔鳞状细胞癌[17]、头颈部鳞癌[18]、皮肤基底细胞癌[19]等。Uemura 等[16]通过荧光差异双向电泳和组织芯片研究发现食管鳞状细胞癌中TGM3高表达患者预后较好。Wu 等[18]发现外源性高表达TGM3可以抑制头颈部鳞癌细胞的增殖并促进凋亡。刘军等[15]通过流式技术研究50例喉癌与癌旁组织TGM3表达差异,发现TGM3在喉癌中低表达并且与肿瘤转移、分化及临床分期相关。以上研究表明TGM3参与多种肿瘤的发生、发展过程,但在HCC中尚未见报道。

本文首先通过HCC根治性切除术后患者的病理标本和随访资料,探究TGM3在HCC及癌旁的表达水平及其对于HCC预后的预测价值;其次通过体内外实验研究TGM3对于HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响;最后对TGM3在HCC发挥作用的可能分子机制进行初步研究。

资 料 和 方 法

患者信息收集28例2018年1月在复旦大学附属中山医院行HCC根治性切除术患者的癌和癌旁组织,用于检测TGM3在mRNA和蛋白水平在癌和癌旁的表达差异。同时选取从2012年1月至12月在我院行HCC根治性切除术的患者92例,分析TMA染色结果及随访资料。本研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会审查,相关患者均签署知情同意书。

细胞培养人HCC细胞系(7721、Huh7、HepG2)购自中国科学院上海细胞库。人HCC细胞系(L02、MHCC97H、MHCC97L和HCCLM3)由复旦大学肝癌研究所提供。所有细胞均用含有10%FBS的DMEM培养基(美国赛默飞世尔科技公司)置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

qRT-PCR使用RNeasy mini kit(德国Qiagen公司)提取细胞总RNA,然后使用SuperScript Ⅲ Platinum SYBR green one-step qRT-PCR kit (美国赛默飞世尔科技公司)检测目的基因表达量。反应体系SuperScript®Ⅲ RT/Platinum®Taq Mix 1 μL,2×SYBR®Green Reaction Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,ROX染料 0.1 μL,总RNA 5 μL,ddH2O 16.9 μL。反应条件:cDNA合成50 ℃、3 min;预变性95 ℃、5 min;95 ℃、15 s,60 ℃、30 s 重复40个循环。使用GAPDH作为内参。所用引物序列如下:TGM3,F:5’-ATGGCTGCTCTAGGAGTCCAG-3’,R:5’-GTTTTGGCCTCTCCGCAAGAT-3’;GAPDH,F:5’-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3’,R:5’-AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。用2-ΔΔCt值表示HCC的TGM3表达水平相对于癌旁的变化。

Western blot使用RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解细胞,12 000×g离心10～15 min后收集上清,再用BCA法检测蛋白质浓度。配置SDS-PAGE凝胶后上样、电泳、转膜、封闭,一抗4 ℃孵育过夜:TGM3 (1∶500)、pAKT (1∶1 000),ERK (1∶500)、pERK (1∶750)、p65 (1∶500)、Caspase 3 (1∶1 000)、Cleaved caspase 3 (1∶500)、E-Cadherin (1∶1 000)、N-Cadherin (1∶800)、Fibronection (1∶750)、Vimentin (1∶800),购自英国Abcam公司;GAPDH (1∶2 000,美国Proteintech公司);AKT (1∶800,美国CST公司);p-p65 (1∶500,美国BD公司),匹配二抗(英国Abcam公司)室温孵育2 h,ECL化学发光检测结果。使用Image J软件进行灰度分析。

细胞增殖检测取对数期细胞,消化、计数后96孔板铺板,每孔5 000个细胞,100 μL体系,培养规定时间后加入10 μL CCK-8(日本东仁化学研究所),孵育2 h后于450 nm波长处检测吸光度(D),连续测量4天。

克隆形成实验取对数期细胞,消化、计数后6孔板铺板,每孔1 000个细胞,2 mL体系,每4天换液1次,2周后去除培养基,4%多聚甲醛固定,0.05%结晶紫染色后拍照、计数。

Transwell小室细胞侵袭和迁移实验稀释Matrigel (美国Corning公司)至工作浓度,包被Transwell小室。取对数期细胞消化、计数后加入小室上室,每个上室加入105个细胞,培养体系为100 μL 含1% FBS的DMEM培养基,小室下室加入600 μL含10% FBS的DMEM培养基,作为趋化因素。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24或48 h,观察到有适量细胞穿出到下层即可终止实验。取出小室,甲醇固定、结晶紫染色后拍照计数,记录200×放大倍数下10个随机视野。迁移实验方法同上,但无需在小室上包被Matrigel。

TGM3敲减稳转细胞株构建TGM3慢病毒敲减载体由上海吉凯基因化学技术有限公司构建,共构建2个敲减载体shTGM3-1、shTGM3-2及一个阴性对照(Mock)。转染前一天6孔板铺板,每孔1×105个细胞,转染时用含5 μg/mL聚凝胺培养基稀释慢病毒至适宜浓度后与细胞混合,转染12 h后换回常规培养基,3 μg/mL嘌呤霉素筛选3天后进行后续实验。

组织芯片与免疫组化本研究利用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法进行免疫组化染色。手术切除标本常规石蜡包埋、切片后保存于4 ℃。脱蜡复水和抗原修复后于4 ℃过夜孵育TGM3一抗,然后37 ℃二抗孵育30 min,最后行DAB显色和苏木精复染。TGM3染色结果判定方法如下,A:根据瘤细胞着色深浅分为4个等级,即0(不着色)、1(浅黄色)、2(棕黄色)、3(棕褐色);B:根据显色细胞比例也分成4个等级,即1 (1%～10%)、2 (11%～50%)、3 (51%～80%)、4 (>80%);评分=A×B,0～4分:低表达;5～12分:高表达。

裸鼠皮下成瘤实验10只6周龄雄性裸鼠购于中国科学院上海实验动物中心,在SPF级环境中饲养,适应3天后,将裸鼠随机分成两组,每组5只,选择Huh7细胞进行实验,分别于左侧腋下注射5×106个shTGM3-2 (实验组)和Mock细胞(对照组),5周后颈椎脱臼法处死小鼠,取瘤测量后计算肿瘤体积,计算公式为:体积=0.5×长×宽2。

统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。连续型变量采用t检验或单因素方差分析,分类变量采用χ2检验或Fisher精确检验。用Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验研究TGM3与患者复发时间或总生存时间(overall survival,OS)的关系。用Cox回归模型研究多因素对于患者生存和复发的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

TGM3在HCC中高表达检测28例HCC患者癌和癌旁组织TGM3 mRNA表达水平,发现在46.4%的HCC组织中TGM3明显高表达(≥2倍,图1A),进一步检测蛋白质水平的变化,发现TGM3蛋白在HCC中的表达亦显著升高(图1B)。

TGM3高表达HCC患者预后较差对92例在行HCC根治性切除术患者的癌和癌旁组织组成的组织芯片进行免疫组化分析,根据染色结果将患者分为TGM3高表达和TGM3低表达组(图1C),结合临床随访数据分析患者不同临床病理参数与TGM3表达水平之间的关系(表1)。TGM3表达水平与埃德蒙森分级(Edmondson stage)显著相关。Kaplan-Meier生存分析表明TGM3高表达组的中位复发时间和中位生存期均较低表达组显著缩短(15.00个月vs.49.25个月,P<0.05,图1D;38.63个月vs.未达到,P<0.05;图1E)。多因素Cox回归分析发现,TGM3的表达高低对于复发时间和生存时间的影响差异有统计学意义(HR=2.31,95%CI:1.08～4.91,P=0.029;HR=2.78,95%CI:1.28～6.00,P=0.009;表2)。以上结果表明,TGM3表达量较高的HCC患者预后较差,TGM3是HCC患者术后复发和死亡的独立预后因素。

A:Relative TGM3 expressions assessed via qRT-PCR from tumors and paired adjacent normal liver tissues of 28 HCC patients.B:Representative TGM3 protein levels assessed via Western blot from tumors (T) and paired adjacent normal liver tissues (N) of HCC patients.C:Typical IHC images of HCC specimens that define high or low expression staining for TGM3 on TMA (bar=100 μm).D:Kaplan-Meier analysis of recurrence in HCC patients with different levels of TGM3 expression.E:Kaplan-Meier analysis of OS in HCC patients with different levels of TGM3 expression.

图1 TGM3在HCC患者癌和癌旁组织的表达水平及其对患者预后的影响
Fig 1 The expression level of TGM3 in HCC tumors and adjacent normal liver tissues and its clinical relevance with patient outcome

TGM3下调抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭分别在mRNA和蛋白水平评估HCC细胞系(L02、7721、Hep G2、Huh7、LM3、97H、97L)内源性TGM3的表达水平,发现TGM3在Huh7、LM3和97H细胞株的mRNA和蛋白表达水平都较高(图2A)。选取Huh7和97H细胞株进行后续的基因敲减实验,分别用2个慢病毒载体(shTGM3-1和shTGM3-2)敲减细胞,Western blot检测敲减结果(图2B)显示TGM3表达明显降低。利用TGM3敲减细胞进行细胞增殖实验,发现与转染阴性对照相比,下调TGM3表达显著抑制HCC细胞的增殖(P<0.05,图2C);与增殖实验一致,克隆形成实验结果显示下调TGM3表达可显著抑制HCC细胞克隆形成(P<0.01,图2D)。利用Transwell小室实验评估下调TGM3表达对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响,发现干扰后细胞迁移和侵袭能力均显著下降(P<0.05,图2E和2F)。以上结果表明,TGM3下调能抑制HCC细胞Huh7和97H的增殖、迁移和侵袭。

表1 入组患者临床病理参数分析Tab 1 Correlation between clinicopathological parameters of patients enrolled

ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate transaminase;AFP:α-fetoprotein;BCLC:Barcelona clinic liver cancer.

TGM3下调抑制HCC细胞皮下成瘤通过Huh7细胞裸鼠皮下成瘤实验进一步研究TGM3对HCC成瘤能力影响。将实验组(shTGM3-2)和对照组(Mock)细胞各5×106个分别接种于两组小鼠左侧腋下,5周后处死小鼠取瘤,观察发现实验组肿瘤体积显著小于对照组(P<0.05,图3),提示TGM3表达降低可以抑制HCC细胞系Huh7的皮下成瘤能力。

TGM3下调抑制HCC细胞生长、迁移相关信号通路并促进调亡PI3K/AKT、MAPK/ERK及NF-κB信号通路处于细胞信号通路网的重要节点,在细胞的生长、增殖、分化、代谢、凋亡、运动等过程中起重要作用,它们的调控异常与多种肿瘤的发生相关[20-22]。利用Western blot验证相关信号通路蛋白的变化(图4A),探究TGM3影响HCC细胞增殖、迁移、侵袭及皮下成瘤能力的具体机制,发现TGM3下调后AKT及ERK的磷酸化水平均下降,同时引起下游p65磷酸化水平降低。同时检测凋亡相关蛋白caspase 3的变化水平,发现其在TGM3下调的细胞中表达升高。以上结果表明,TGM3下调后可能通过PI3K/AKT、MAPK/ERK及NF-κB信号通路减弱HCC的生长和转移,同时促进凋亡。

表2 复发与死亡的多因素Cox回归分析Tab 2 Multivariate Cox proportional regression analysis of factors associated with recurrence and deadth

BCLC:Barcelona clinic liver cancer;HR:Hazard ratio.

A:TGM3 expression in HCC cell lines assessed by qRT-PCR and Western blot;B:Validation of TGM3 depletion assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells;C:Proliferation of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion assessed by CCK-8 assays;D:Proliferation of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion assessed by colony formation assays (bar=5 μm);E:Migration of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion evaluated by Transwell assays without Matrigel (bar=100 μm);F:Invasion of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion evaluated by Transwell assays with Matrigel (bar=100 μm).(1)vs.mock,P<0.05.

图2 常见HCC细胞系内源性TGM3表达水平及TGM3下调后对于HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响
Fig 2 The endogenous TGM3 expression levels of common HCC cell lines and the influence of TGM3 depletionon cell proliferation,migration and invasion

TGM3下调抑制HCC细胞EMT过程EMT与细胞的迁移侵袭能力密切相关[23],我们已经通过Transwell小室实验发现TGM3下调后HCC细胞迁移、侵袭能力下降。Western blot检测EMT相关蛋白变化(图4B)结果表明,TGM3敲减后,上皮表型标志物E-钙黏素表达水平上调,间叶表型标志物N-钙黏素、纤维连接蛋白及波形蛋白均下调,表明TGM3下调后能抑制HCC细胞EMT过程。

A:Macrograph of subcutaneous tumors;B:Statistic of tumor volumes.

图3 TGM3下调后对Huh7细胞皮下成瘤能力的影响
Fig 3 The influence of TGM3 depletion of Huh7 on subcutaneous xenotrans planted tumorigenesis

A:Effect of TGM3 depletion on the activation status of AKT,ERK,p65 and caspase 3 assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells.B:Effect of TGM3 depletion on the expression of EMT markers assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells.

图4 TGM3下调对HCC细胞相关信号通路、细胞凋亡和EMT相关标志物的影响
Fig 4 The influence of TGM3 depletion on the markers of HCC signaling pathways,apoptosis and EMT

讨 论

TGM3广泛表达于小肠、脑、皮肤和毛囊,在角质化细胞套膜骨架形成及毛发的生成中起重要作用。TGM3表达异常与多种肿瘤发生相关,在喉癌、食管鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌及头颈部鳞癌中的研究显示TGM3在肿瘤组织中低表达,可能是肿瘤抑制因子[15-18]。TGM3在HCC中的作用尚未见报道。本文旨在研究TGM3对于HCC的发生、发展有无影响。首先,通过比较TGM3在HCC及癌旁组织的表达差异发现,TGM3在HCC中高表达,进一步结合临床随访数据,利用Kaplan-Meier及Cox回归分析发现,TGM3表达水平是HCC术后复发和死亡的独立影响因素,TGM3高表达的患者术后复发和死亡风险更高。所以在临床实践中,如果HCC患者术后病理提示TGM3高表达,临床医师可采取更加积极的治疗措施来预防患者的复发和死亡。但这只是单中心少量样本的统计结果,在临床中的实际应用价值还需要多中心及更大样本量的数据支持。

为研究TGM3对HCC的生物学作用,我们利用shRNA降低HCC细胞系中TGM3的表达水平,通过细胞增殖实验和克隆形成实验发现,TGM3下调后HCC细胞的增殖能力减弱,裸鼠皮下成瘤实验进一步验证了这个结论。Transwell小室实验验证了下调TGM3的表达能够减弱HCC细胞的迁移和侵袭能力。以上结果表明,TGM3可能通过影响细胞增殖和迁移等相关信号通路促进HCC的生长和转移。PI3K/AKT信号通路在细胞的生命活动中起重要的调控作用,通过与其他信号通路的相互作用共同影响细胞生长、增殖、代谢、迁移等多种病理生理过程,PI3K/AKT及MAPK/ERK信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生发展有关[20-21,24]。本研究通过Western blot实验证实TGM3下调后可以抑制HCC细胞AKT和ERK的磷酸化水平。AKT下游可以激活NF-κB信号通路,而NF-κB信号通路的异常激活在肿瘤侵袭和凋亡方面起重要作用[25-26]。本研究通过Western blot证实TGM3下调后p65蛋白的磷酸化水平降低,凋亡蛋白cleared caspase 3水平升高。

PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB信号通路都能对EMT过程起调控作用,而EMT与肿瘤的侵袭密切相关。在EMT过程中,上皮表型标志物E-钙黏素下调,间叶表型标志物N-钙黏素、纤维连接蛋白及波形蛋白上调。EMT能使上皮细胞失去极性及细胞间黏附,获得迁移和侵袭性质,从而促进肿瘤细胞转移[27-28]。Transwell小室实验已证实下调TGM3表达能减弱HCC细胞的迁移和侵袭能力,通过Western blot检测EMT相关蛋白的变化,证实TGM3下调能抑制EMT过程。

我们认为TGM3可能通过激活PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB信号通路,促进EMT过程和抑制凋亡来促进HCC的发生和发展,TGM3可能是肿瘤促进因子,这与既往文献有一定差异。由于肿瘤遗传及代谢的高度异质性,同一个基因在不同肿瘤中可能存在不同的功能,甚至在同一类型肿瘤的不同阶段也会产生不同作用[29]。因此,TGM3在不同肿瘤中可能扮演着不同的角色。

本研究的不足之处在于:首先,TGM3是如何参与调控相关的信号通路并影响下游重要信号分子的机制仍需要进一步的阐明;其次,TGM3作为临床预后指标的价值还需要更大样本量的验证。

综上所述,本研究发现TGM3可能通过影响多条信号通路和EMT过程促进HCC的增殖和侵袭,TGM3可作为HCC患者潜在的预后指标和治疗靶点。