类风湿关节炎外周Foxp3、TGF-β1与动脉粥样硬化的关系

牟晓月 张幽幽 陶海英 金 都

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)一种慢性、进行性、对称性多关节破坏为特征的全身性自身免疫病，以滑膜炎为主要病理改变，其发病机制尚不清楚，我国的发生率约为0.34%～0.36%，中年女性是高危人群[1]。早期主要表现为关节红肿及功能障碍，如果不能及时和正规治疗，发病2年左右后约有一半患者发生关节畸形，甚至随着病情的进展可以致残[2]。RA患者的平均寿命可以减少5～10年，其死亡的首要原因是心血管疾病，有将近50%的RA患者死于心血管疾病[3，4]。国外研究发现，RA患者患动脉粥样硬化的风险高于正常人群，症状较为隐匿，常无心绞痛症状[5]。目前国内对这一病变研究还相对较少。RA以局限性或系统性慢性炎症为特点，而动脉粥样硬化的病理基础也是动脉内膜的慢性炎症，RA和动脉粥样硬化之间可能存在密切联系。因此，借助慢性炎症这一共同桥梁，研究RA患者中动脉粥样硬化的发生炎症机制，对RA患者动脉粥样硬化预防和治疗具有重要意义。叉头转录因子3(forkhead transcription factor 3,Foxp3)是特异性表达于调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)内的标志性分子，在免疫耐受和免疫抑制效应中发挥决定性作用[6]。转化生子因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在炎症的发生、发展过程中发挥重要意义，参与了组织修复、细胞周期调节，同时也具有免疫抑制的作用[7]。因此，本研究通过探讨RA患者外周血Foxp3和TGF-β1表达及与动脉粥样硬化关系，为RA患者动脉粥样硬化预防和治疗提供一个新的思路。

资料与方法

1.一般资料：选取2016年1月～2018年5月在笔者医院收治确诊为RA的患者126例作为RA组，其中男性20例，女性106例，患者年龄26～64岁，平均年龄48.07±16.31岁。根据超声检查颈动脉内膜中层厚度(inteima-media thickness，IMT)，IMT<0.9mm表示正常，0.9mm≤IMT≤1.3mm提示内膜增厚，IMT>1.3mm表示有动脉斑块，以此为标准，将RA组分为RA有斑块组62例和RA无斑块组64例。纳入标准：①所有患者均符合美国风湿协会(American Rheumatism Association，ARA)1987年修订的关于RA的诊断标准[8]；②本研究征得研究对象及家属知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①合并其他自身免疫性疾病患者；②半年内使用激素或免疫抑制剂治疗患者；③明确有心血管疾病患者；④严重肝脏、肾脏疾病和肿瘤患者。同时选择笔者医院健康体检志愿者62例作为正常对照组，其中男性8例，女性54例，年龄22～60岁，平均年龄45.57±19.18岁。本研究获得台州市第一人民医院伦理学委员会批准。

2.病史及标本采集：收集所有研究对象的身高、体重，计算体重指数(body mass index，BMI)，记录RA组患者的病程、既往史，进行全身体格检查，用2处关节炎疾病活动分数(disease activity score 28，DAS28)计算器计算DAS28评分。采集清晨空腹静脉血8ml，分两管，第1管加入TRIzol 1ml后-80℃保存备用；第2管分离血清后-80℃保存备用。

3.生化指标的检测：取出-80℃保存的血清，用全自动生化分析仪测定总胆固醇 (total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)水平。

4.用酶联吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测血清中TGF-β1水平：将一抗稀释至10μg/ml，加入到96孔板中，0.1毫升/孔，4℃过夜，洗涤3次，加血清0.1ml于上述反应孔中，37℃孵育1h；加入0.1ml二抗，孵育1h；加入显色液0.1ml，显色20min；加入0.05ml浓度为2mol/L的硫酸终止反应，在450nm处测各孔吸光度(A)值。TGF-β1试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

5.用实时荧光RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)检测外周血Foxp3 mRNA的表达：取处-80℃保存的加TRIzol全血，根据RNA提取试剂盒操作说明书提取RNA，根据反转录试剂盒说明合成cDNA，根据SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增。条件为95℃ 30s预变性、95℃ 5s变性、60℃ 44s、40个循环，61℃时采集荧光，用实时荧光定量PCR仪检测对其表达量进行结果分析，以GADPH作为内参，采用 2-△△Ct法计算mRNA 的相对表达量。

6.IMT超声检查：用多普勒彩色超声显像仪对所有研究对象进行IMT检测，分别测量左右两测颈总动脉、颈内动脉和颈动脉分叉部的IMT，取平均值。IMT测量与资料采集的同一天完成。采用双盲法，由经验丰富的超声医生进行检测。

结 果

1.3组研究对象基本资料的比较：3组研究对象的年龄、BMI与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；RA无斑块组和RA有斑块组研究对象的TC、TG、LDL高于正常对照组，HDL低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；RA有斑块组研究对象的TC、TG、LDL高于RA无斑块组，HDL低于RA无斑块组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 3组研究对象基本资料的比较

与正常对照组比较，*P<0.05；与RA无斑块组比较，#P<0.05

2.3组研究对象TGF-β1和Foxp3水平的比较：RA无斑块组和RA有斑块组研究对象血清中TGF-β1水平和Foxp3 mRNA的相对表达量低于正常对照，差异有统计学意义(P<0.05)；RA有斑块组研究对象血清中TGF-β1水平和Foxp3 mRNA的相对表达量低于RA无斑块组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 3组研究对象IMT、TGF-β1和Foxp3水平的比较

与正常对照组比较，*P<0.05；与RA无斑块组比较，#P<0.05

3.回归模型分析：以IMT为应变量(Y)，病程、TC、TG、HDL、LDL、DAS28、TGF-β1和Foxp3为自变量(x)进行回归分析，筛选出动脉粥样硬化的影响因素。结果显示回归方程差异有统计学意义(P<0.05)，TC、LDL、Foxp3和TGF-β1为动脉粥样硬化的危险因素(P<0.05)，HDL为动脉粥样硬化的保护因素(P<0.05，表3)。

表3 动脉粥样硬化影响因素的回归分析(n=96)

讨 论

RA是一种由自身免疫性T细胞对自身抗原产生特异性免疫应答而引起的自身免疫性疾病，T 细胞及其亚群的功能紊乱和分泌细胞因子异常在RA的启动过程中发挥了关键性作用。CD4+CD25+Treg(regulatory T cell，Treg)细胞是一种具有免疫抑制功能的T细胞亚群，可以抑制T细胞的活性和功能，维持机体的免疫耐受[9]。研究表明，Treg细胞可以通过抑制性细胞因子依赖机制和细胞接触性依赖机制抑制自身免疫 T 细胞的活化，显著抑制其他T细胞亚群的增殖[10]。Foxp3是Treg细胞内的一种转录因子，在Treg细胞细胞特异性表达是Treg细胞发挥生物学活性的关键因素，在免疫抑制和免疫耐受中发挥决定性地位[11]。Foxp3基因突变与免疫失调性基因疾病、X-相关综合征、多发性内分泌腺体病等多种自身免疫性疾病密切相关，Foxp3表达降低或功能缺陷可以引起自身免疫性胃炎、特发性关节炎和多发性硬化症等，Foxp3的高表达可以使Treg细胞产生大量免疫抑制因子(如白细胞介素-10)，如白细胞介素-10通过TGF-β依赖性和细胞接触方式对致病性T细胞发挥直接作用，产生促炎因子减少[12，13]。

有研究显示，TGF-β1能调节Foxp3的表达[14]。TGF-β1参与胚胎发育、免疫抑制、组织修复等多种生物学功能，但其生物学效应依赖于Smads蛋白的信号转导及调控，TGF-β1信号从细胞表面转导至细胞核的过程中依赖于Smads家族蛋白[15]。Smads蛋白共有 3 类：受体活化型Smad(R-Smads)、抑制型Smad(I-Smads)和共同通路型Smad(Co-Smad)，不同Smads蛋白介导不同的TGF-β信号转导[16]。TGF-β1作为受体复合物，通过TGF-β1/Samds 信号转导通路，诱导Smads蛋白进入细胞核内，抑制其靶基因(Foxp3)的转录，使Foxp3 表达下调[14]。这些研究表明，当Foxp3和TGF-β1表达降低时，它们对自身免疫 T 细胞的抑制作用减弱，导致自身免疫性T细胞对自身抗原产生特异性免疫应答，引起终生免疫性疾病。本研究结果显示，在RA组研究对象外周血Foxp3和TGF-β1的表达降低。

RA患者发生心肌梗死的风险是正常人群的2～3倍，脑卒中的风险上升1.7倍[17]。动脉粥样硬化是心血管疾病发生的基础，其发生、发展过程是脂质与纤维成分在大动脉沉积，目前认为动脉粥样硬化是一种慢性炎性疾病。RA的病理基础是关节滑膜组织的炎症，导致如白细胞介素-16、α-肿瘤坏死因子等炎性因子释放入血。这些炎性因子不仅调节机体免疫反应，而且能作用于脂肪组织和血管内皮等组织，使机体出现胰岛素抵抗、脂质代谢紊乱和内皮功能障碍等，导致促使RA患者动脉粥样硬化加速进展[18]。近年来研究提示，脂肪因子可能成为RA疾病发生、发展的生物标记，其不仅与健康人群有差异，还与病情和病程密切相关，而且脂肪因子在动脉粥样硬化发病过程中的作用也得到证实[2]。RA患者在炎性因子的作用下，导致HDL降低，LDH表达增加，这与本研究结果一致。本研究结果显示，TC、Foxp3和TGF-β1为炎性动脉粥样硬化复发的独立危险因素，HDL为炎性动脉粥样硬化的独立保护因素，笔者推测，RA患者发生动脉粥样硬化的作用过程是Foxp3和TGF-β1表达受到抑制，导致炎性因子释放增加引起脂肪代谢紊乱，促使动脉粥样硬化的发生。

综上所述，类风湿关节炎患者外周血中Foxp3、TGF-β1表达明显受到抑制，参与动脉粥样硬化的发生、发展。但由于本研究属于横断面的调查，结果的说服力欠佳，后续将对RA患者进行随访，动态检测Foxp3、TGF-β1水平，进一步探讨Foxp3、TGF-β1与动脉粥样硬化的关系，为RA患者合并动脉粥样硬化的早期诊断和治疗提供一个新的思路。