miR-34a及靶蛋白Foxp1对寻常型银屑病的作用研究

王慧琴 王 瑶 赵宗峰 吴卫东

银屑病(psoriasis)是一种常见的慢性炎性皮肤病，以表皮角质形成细胞异常增生和角化不全为主要病理改变的。目前银屑病无法根治，并且具体的发病机制尚不明确，研究在银屑病的发生、发展中微小核糖核酸即miRNA起到了重要作用[1～3]。本研究选择miR-34a及其靶蛋白Fxop1为研究对象，运用实时荧光定量PCR法检测miR-34a在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达水平；在前期实验基础上培养HaCaT细胞，并转染miR-34a模拟物和抑制剂由此来研究下游靶蛋白Foxp1的表达是否受其调控；具体分析如下。

材料与方法

1.材料：寻常型银屑病皮损组织选自2012～2016年在笔者医院皮肤科就诊并确诊的患者12例，其中男性5例，女性7例，患者年龄19～71岁，平均年龄44.417±17.547岁；取材前未使用过相关药物及治疗；不伴有其他免疫和肿瘤疾病；排除妊娠、哺乳期等女性；以此为病例组。正常皮肤组织取自泌尿外科、整形外科、截肢者手术切除的皮肤共12例，其中男性6例，女性6例；患者年龄7～60岁，平均年龄27.500±24.333岁,以此为正常对照组，正常对照组需排除自身免疫性疾病、遗传性疾病，并无银屑病家族史。本研究获笔者医院伦理学委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

2.核酸提取：取冻存组织30～50mg，迅速置于研钵，倒入液氮研磨，然后根据miRNeasy Mini kit(德国Qiagen公司)说明书操作，进行核酸提取。提取的样本总RNA用超微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo公司)测定其浓度及纯度，A260/A280比值在1.8～2.2，用于后续实验。

3.反转录：使用miScript Ⅱ RT kit反转录试剂盒(德国Qiagen公司)，包含4种试剂5×HIFlex Buffer，10×Nucleics Mix，RT Enzyme Mix，RNase-Free H2O2；反应体系为20μl，反应在Bio-Rad C1000 Touch PCR 仪(美国Bio-Rad公司)上进行。反应体系：5×HIFlex Buffer 4μl，10×Nucleics Mix 2μl，RT Enzyme Mix 2μl，Total RNA+ RNase-Free H2O2共 12μl。将加好试剂的EP管放置于C1000 Touch PCR仪反应槽中，设置反应条件：37℃ 60min，95℃ 5min。收集反转录产物进行后续实验。

4.实时荧光定量PCR：用miScript SYBR®Green PCR kit 试剂盒(德国Qiagen公司)，包含Quantitect SYBR Green PCR Master Mix和RNase-Free H2O2两种试剂；反应体系为20μl：2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10×miR-34a特异性引物 2μl，10×U6 2μl，RNase-Free H2O25μl，模板 1μl。miR-34a特异性引物及U6均购自德国Qiagen公司成品。反应在Rotor Gene-Q仪(德国 Qiagen公司)上进行，反应条件：95℃ 15min，1个循环；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40个循环。每个样本做3个复孔，反应结束后用Rotor-Gene Q Series Software软件进行数据导出和分析，得出曲线及Ct值。

5.细胞培养及转染：37℃，5%CO2条件下培养HaCaT细胞(江苏南京凯基生物技术公司)，培养基为DMEM培养液(美国Gibco公司)，加入10%胎牛血清(美国Gibco公司)，同时添加双抗(美国Sigma公司)。化学合成成品miR-34a mimic(德国Qiagen公司)和miR-34a inhibitor(德国Qiagen公司)，用Lipofectamine2000试剂盒(美国Invitrogen公司)转染细胞。转染时的细胞密度能够达到30%～50%；稀释miRNA，稀释lipo2000轻轻混匀并室温孵育20min；将miRNA-lipo2000 混合液加入含有细胞的500μl 培养基的培养孔中，轻轻混匀；培养4～6h后，将孔中含siRNA-lipo2000 混合液的培养基移去，更换新鲜培养基；将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养48h。

6.Western blot(WB)法检测Foxp1表达：转染成功后收集细胞，RIPA裂解细胞，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。12%分离胶进行SDS-PAGE电泳；蛋白样本电泳分离，转印到PVDF膜上，用5%蛋白质干粉TBST封闭1h；TBST洗膜10min 3次，加Foxp1一抗(英国Abcam公司)1∶1000室温孵育1h；TBST洗膜10min 3次，稀释二抗1∶1000室温孵育1h；TBST洗膜10min 3次，暗室曝光定影。WB实验过程中的所有试剂除一抗外均购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

结 果

1.实时荧光定量PCR检测结果:实时荧光定量PCR以U6扩增作为参照， miR-34a扩增良好(图1、图2)。病例组miR-34a的表达高于正常对照组，即寻常型银屑病患者皮损组织中miR-34a呈高表达，差异有统计学意义(t=3.047，P=0.011，表1)。

图1 实时荧光定量PCR检测miR-34a的扩增曲线图

图2 实时荧光定量PCR检测miR-34a的溶解曲线图

组别nmiR-34atP正常对照组120.0067±0.00213.0470.011病例组120.0243±0.0199*

与正常组织比较,*P<0.05

2.Western blot法检测结果:培养并转染HaCaT细胞，转染分为3个组，即正常对照组、miR-34a过表达组、miR-34a 抑制表达组。Western blot法检测3组Foxp1蛋白表达结果：miR-34a过表达组Foxp1蛋白表达量高；miR-34a抑制表达组Foxp1蛋白表达量低；差异有统计学意义(F=286.722，P=0.000)。LSD法组间比较显示,与正常对照组比较，miR-34a抑制表达时Foxp1蛋白表达降低(P=0.002)；与正常对照组比较，miR-34a过表达时Foxp1蛋白表达量增加(P=0.000)；miR-34a过表达组与miR-34a抑制表达组Foxp1蛋白表达量比较，差异有统计学意义(P=0.000，表2、图3)。

表2 miR-34a转染细胞后不同组中Foxp1蛋白Western blot法检测表达量

图3 不同细胞转染组中Foxp1蛋白表达水平图

讨 论

银屑病俗称牛皮癣，是一种多基因遗传背景下受多因素调控的慢性炎性疾病。有研究表明,miRNA与皮肤生理、生化、免疫等许多过程均有重要相关性[2～5]。miR-34a定位于人类1p36染色体上，共有110个核甘酸序列，单独转录表达[6]。研究发现miR-34参与了Cyclin/CDK-pRb 途径，通过向肿瘤细胞转染能够引起G1期细胞周期停滞，并且miR-34与细胞周期密切相关[7]，miR-34在癌细胞中重新激活可诱发caspase调控的凋亡途径[8]。此外，miR-34也可能与其他miRNA发挥协同作用，Bandi等发现miR-34a与miR-15/16共同作用诱导细胞周期阻滞，而且miR-34a及miR-15/16在肿瘤中均低表达[9]。miR-34a可通过调节其靶基因而参与细胞增殖、凋亡、存活、迁移、侵袭以及血管生成等生物过程[7,10]。因此本研究选择miR-34a为切入点，检测其在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达；并通过细胞培养进行离体研究，观察靶蛋白Foxp1量的变化，综合多种方法来探究二者与银屑病发病可能的关系。

实时荧光定量PCR实验的结果说明：miR-34a在寻常型银屑病皮损组织中呈高表达，其与正常健康皮肤组织的差异有统计学意义(t=3.047，P<0.05)。禹欢欢等[1]、陈春丽等[4]、杨志波等[11]利用不同技术方法得出miR-34a在银屑病中表达明显上调，与本研究结果一致。笔者推测miR-34a异常表达促使表皮角质形成细胞凋亡加速，过度增殖；细胞周期的变化使病理改变推进，因此miR-34a参与了寻常型银屑病发病过程。

叉头框蛋白p1(forkhead box P1，FOXP1)是miR-34a的重要靶基因，位于染色体3p14.1，完整编码产物含677个氨基酸的蛋白，在人类组织上有广泛的、程度不同的表达[12～14]。叉头框蛋白P1(Foxpl)基因隶属于FOX(forkhead box)家族的P亚族。FOX家族是一个庞大的、功能广泛并且进化保守的转录因子家族，其特点是具有叉头螺旋结构(forkhead/winged helix,FKH)[13～15]。FOX家族蛋白参与了如胚胎发育、细胞周期调控、糖类和脂类代谢、免疫调节等过程，其突变和表达异常可导致发育畸形、代谢紊乱以及肿瘤的发生等疾病[11～18]。Foxp1受miR-34a调控参与多种生物学过程，并与皮肤性疾病的生理、免疫等密切相关。有研究表明在皮肤基底细胞癌中FOXP1蛋白的阳性表达率显著高于癌旁组织[19]。陈春丽等[16]利用免疫组化研究发现Foxp1蛋白表达在正常皮肤组织中的阳性率低于寻常性银屑病皮损中的表达，且阳性主要于表皮全层细胞核表达。这与笔者转染HaCaT细胞的研究结果一致：培养HaCaT细胞并转染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后，Western blot法检测结果表明，miR-34a过表达时Foxp1蛋白表达量增加；miR-34a抑制表达时Foxp1蛋白表达量降低，差异有统计学意义(F=286.722,P<0.01)。

综上所述，笔者推断在寻常型银屑病发病过程中高表达的miR-34a通过调控其靶蛋白Foxp1参与了表皮细胞的异常增殖过程。表皮角质形成细胞异常增生的过程说明细胞周期被打乱，细胞凋亡加速，免疫调节紊乱，由此认为miR-34a及其靶蛋白Foxp1与寻常型银屑病的发病密切相关。