Notch信号通路在骨重建过程中的双向调节作用

周灵通 黄凯 宋敏* 刘小钰 蒋林博 侯红燕 董万涛,2

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020

骨骼在微观层面是一种由骨形成(bone formation)与骨吸收(bone resorption)紧密耦合的动态组织，维持骨组织形成与吸收之间动态平衡关系的生理过程被称为骨重建(bone remodeling)[1]。近年来的研究表明，骨重建过程是在特殊的结构——骨重建单元(bone remodeling compartment，BRC)中以基础多细胞元(basic multicellular unit，BMU)的形式进行的。BMU中包含成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等，其中破骨细胞群吸收老化或损伤的骨组织，再由成骨细胞群产生新生骨组织补充，当新生骨组织无法完全补充旧骨吸收所产生的空隙，则导致每个重建周期发生骨质流失，最终引发机体骨量减少或骨质疏松症[2]。

全身或局部BMU相关因子共同调节骨重建处于动态平衡之中，目前研究较多的BMU相关因子包括：OPG/RANK/RANKL系统、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt信号通路及PTH/PTHrP等[3]，Notch信号通路能够影响成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等的增殖、分化，还对成骨细胞前体细胞-骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖、分化、凋亡具有调节作用。有趣的是，Notch信号通路对骨形成及骨吸收的刺激和抑制作用都被广泛报道，其在骨髓间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞生成或分化中的作用出现了“矛盾”的结果[4-7]，表现为对于骨形成-骨吸收偶联关系的双向调节作用。本文就Notch信号通路对成骨细胞、破骨细胞、骨髓间充质干细胞生成、分化及功能的双向调节作用做一综述，以期为相关骨代谢疾病的研究思路提供参考。

1 Notch通路概述

1919年Morgan等发现果蝇中一种特定基因缺损后导致其翅膀边缘出现缺口，因此将该基因命名为Notch，而后的研究表明Notch信号通路在生物体生长发育的复杂调控网络中起重要作用[8]。Notch基因能够编码一类膜蛋白受体(包括：Notch 1、2、3、4)，其配体(包括：Jagged 1、2和Delta[Dll] 1、3、4)是位于相邻细胞表面上的另一种膜蛋白，因此经典的Notch信号传导需要至少2个完整的细胞，即细胞表面表达Notch受体的“信号接收细胞”和表达配体的“信号发送细胞”[9]，Notch信号传导的核心机制在于“信号发送细胞”上的5个Notch配体中的Jagged和Dll 1、4可直接相互作用并激活存在于“接受细胞”上的跨膜Notch受体，Notch受体需要经过3次蛋白水解最终导致Notch通路的激活[10]。第一次水解发生于高尔基复合体，经弗林转化酶(furin)作用后转运到细胞膜形成异二聚体[11]，由此产生的两个Notch片段在膜上保持非共价缔合。当配体结合到Notch受体胞外区后会启动膜上典型的Notch通路活化，该活化过程依赖于“信号细胞”中Notch配体内吞作用形成物理牵引机制[12-13]，产生ADAM金属蛋白酶(α-分泌酶)，催化肽键断裂释放Notch胞外区，完成第二次水解。然后，由γ-分泌酶(γ-secretase)在靠近胞膜内的部位“切割”(第三次蛋白水解)[14],释放Notch细胞内段NICD结构域转位至细胞核，与DNA结合蛋白CSL(CBF1/Rbpj)结合后活化Hes和Hey等靶基因的转录，最终对细胞的分化、增殖和凋亡等过程产生效应。

图1 经典Notch信号传导示意图Fig.1 General Notch signaling diagram

除此之外，Notch非经典激活途径也受到关注，细胞微环境中的细胞外基质(ECM)能够直接与Notch受体/配体发生相互作用介导Notch通路下游分子的转录调控[15-16]。微环境中其他常见的生长因子和细胞因子，如TGF-β[17-18]、WNT/β-连环蛋白[19]和血管内皮生长因子(VEGF)[20]等均能够与Notch通路相互作用，引发其与其他信号网络间的“对话”作用。最后，氧气张力、血糖浓度、剪切应力等因素也能在一定程度上影响Notch信号的激活和转录调节[21-23]。

2 Notch通路与骨重建

2.1 Notch通路与成骨细胞

成骨细胞是骨重建过程中负责骨形成作用最主要的细胞之一，在初期骨架形成阶段及后期骨生长过程中起重要作用。骨的形成有两种机制，即膜化骨和软骨化骨，膜化骨主要发生于扁平骨的形成，此过程中间充质干细胞聚集分化为骨祖细胞，并逐渐生长分化为成熟的成骨细胞，成骨细胞分泌 I 型胶原蛋白(Col I)作为构成骨的原材料，还能够产生骨钙素(BGP)和碱性磷酸酶(ALP)促进矿物质的沉积。软骨化骨通过间充质干细胞增殖分化形成软骨雏形，血管入侵后滋养深层骨祖细胞分化为成骨细胞，成骨细胞在软骨表面产生类骨质并逐渐被钙化为骨基质，骨基质包绕形成初级骨松质，成骨细胞不断向骨小梁壁添加新骨基质，同时破骨细胞、碱性磷酸酶等作用下软骨退化形成初级骨化中心，并不断从骨干中段向两端进行，延长骨干长度[24]。

一方面，Notch通路具有促进成骨细胞活性及功能的作用。Engin等[25]研究高表达Notch1细胞内结构域(N1ICD)的转基因小鼠，发现4周龄时X线拍照显示其骨质量增加，11周龄时，甲苯胺蓝染色显示转基因组小鼠的成骨细胞数量增加，组织形态计量学显示骨小梁体积和成骨细胞数显著增加。在成骨细胞MC3T3-E1中转染由腺病毒载体递送的Notch-IC，长期培养后观察到钙化结节形成显着增加[26]。Nobta等[27]对股骨骨缺损小鼠模型行免疫组化发现Notch1在损伤部位成骨细胞中被激活，造模后第5天，Notch1、Delta1和Jagged1的表达均上调，表明在骨再生期间Notch通路上调Notch1、Delta1和Jagged1的表达来促进成骨细胞成骨活性。

另一方面，Notch通路具有抑制成骨细胞活性及功能的作用。缺失Notch基因的突变小鼠胚胎成骨细胞中骨涎蛋白(Ibsp)、ColⅠ和ALP的表达水平较正常小鼠增高，说明Notch通路阻断引起成骨细胞过度增殖[28]。Zanotti等[29]的研究发现在Notch过表达的转基因小鼠MC3T3成骨细胞中，胞浆β-连环蛋白水平和ALP活性显著降低，高表达NICD的转基因小鼠成骨细胞中BMP-2、Wnt3a和骨钙素水平较正常组显著下降。而β-连环蛋白、BMP-2、Wnt3a为Wnt/β-连环蛋白、BMPs通路等主要成骨信号通络的关键转录因子，由此可知Notch通路可以通过与其他成骨信号通路交互作用发挥其对成骨细胞分化及成骨功能的抑制作用。

2.2 Notch通路与破骨细胞

破骨细胞是在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)和NF-κB配体(RANKL)受体激活剂的影响下从骨髓前体分化而来的多核巨细胞[30]，是骨重建过程中唯一确定具有降解骨骼作用的细胞，其功能对维持骨形成-骨吸收的动态平衡关系至关重要。破骨细胞的生成、寿命和活性受到全身性激素以及骨微环境中的相邻细胞自分泌和旁分泌细胞因子和生长因子的调节，包括：OPG / RANKL / RANK信号通路、雌激素、整合素、骨钙素、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)及溶酶体等[31]，破骨细胞形成和活化与骨质疏松症、骨硬化病、类风湿性关节炎等疾病关系密切。

Notch通路能够促进破骨细胞生成和活化。Canalis等[32]发现Notch通路中Notch2的ICD片段与核因子(NF)-κB的相互作用，导致Nfatc1(一种破骨细胞生成的关键基因)的转录，最终诱导破骨细胞生成增加。用γ-分泌酶抑制剂及Notch2mRNA抑制剂干预后显示RANKL诱导的破骨细胞形成下降。可见，Notch和NF-κB通路之间可以通过分子交联作用于破骨细胞生成。Zhou等[33]也发现LNX2基因敲除的骨髓巨噬细胞中Numb(一种Notch抑制剂)蛋白的积累增加，同时其分化为破骨细胞的能力减弱。这些均证明Notch通路能够在一定程度上促进破骨细胞生成和活化，促进骨吸收。

Notch通路也能够抑制破骨细胞生成和活化。Notch基因突变导致人体骨骼发育缺陷，如脊椎肋骨发育不全(spondylocostal dysostosis，STD)是由人类Notch配体DLL3突变引起的[34]，而Notch2突变会引起Hagdu-Cheney综合征——一种以面部异常，骨质溶解为特征的罕见疾病[35]。Matthew等[28]对8周龄Notch相关基因缺失(PNN)小鼠胫骨切片的Trap染色显示，基因缺失小鼠在每个骨表面区域具有比对照组更多的破骨细胞，破骨细胞侵蚀的骨表面百分比也增加。Yamada等[36]发现由Delta1激活Notch通路后，减少了破骨细胞前体细胞中巨噬细胞集落刺激因子受体c-Fms的表面表达，并增强骨保护素在基质细胞中的表达，导致破骨细胞生成的下调。Bai等[37]的实验也证实破骨细胞前体中notch1、2、3的缺失能够增强破骨细胞生成和骨吸收。以上表明Notch通路对破骨细胞生成及功能的抑制作用。

2.3 Notch通路与骨髓间充质干细胞

干细胞(stem cell，SC)是指一类具有自我更新和分化能力的多能细胞，根据干细胞所处的发育阶段可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞 (adult stem cell，ASC)。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是存在于骨髓微环境中的具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞[39]，是干细胞家族的重要成员，在适宜的诱导条件下可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多个方向分化。近年来，越来越多的研究表明，随着机体的衰老，骨髓中BMSCs的含量下降，BMSCs向脂肪细胞分化增多而向成骨细胞分化减少，BMSCs成骨成脂分化失衡可能是骨质疏松症的发病机制之一。

Notch通路促进BMSCs成骨分化、抑制BMSCs成脂分化。有学者[39]应用反转录病毒转染hMSCs使Notch1的ICD片段过表达，通过比较细胞内ALP、进行茜素红染色等，证明Notch通路能够促进hMSCs的成骨分化。Tezuka[26]等发现被EGFP-NIC腺病毒感染5天，hMSCs中ALP活性增强，ColⅠ的表达也相应增加，并认为Notch1可能是治疗骨质疏松症的独特靶分子。Nobta等[40-41]也用病毒转染技术使MSCs中Notch配体Jagged1和Delta1过表达，进行成脂诱导后发现其成脂分化相关因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ亚型(PPAR-γ)、脂肪酸结合蛋白-4(FABP-4)较对照组显著降低。DAPT作为γ-分泌酶的抑制剂，能够有效阻断Notch受体的细胞内蛋白水解，是常用的Notch信号通路阻断剂[42]。Yaoting等[43]用DAPT干预成骨诱导分化的BMSCs，发现成骨诱导培养14 d后，DAPT组矿化结节数量明显低于对照组。还有报道[42]显示，DAPT干预BMSCs成骨分化能够显著降低矿化相关基因如细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)、牙本质基质蛋白-1(Dmp1)、硬化蛋白(Sost)和维生素D低磷性佝偻病蛋白(Phex)的表达。

Notch通路也能抑制BMSCs成骨分化、促进BMSCs成脂分化。Sciaudone等[44]应用反转录病毒使NotchIC转染小鼠骨髓基质细胞(ST-2)后，CBF1 / RBP-Jκ途径被激活并且经典Wnt途径被抑制，成脂诱导后发现Notch IC有利于ST-2细胞分化为脂肪细胞。Nicolas等[45]发现在基质细胞如角质形成细胞中，也存在Notch IC缺失导致β-连环蛋白水平升高，重新引入Notch受体后可以抑制β-连环蛋白水平增高的现象，可知Notch信号在一定条件下具有抑制Wnt信号传导的作用。Liu等[46]在系统性红斑狼疮(MRL/lpr小鼠)小鼠模型中,观察到BMSCs中Notch信号的持续活化：Notch1、Notch2、Jag1和NICD蛋白的高表达，同时观察到模型小鼠严重的骨质疏松表型。当通过DAPT间歇性抑制MRL/lpr小鼠中的Notch信号传导时，其骨形成作用显著增强。

3 Notch基因突变与骨骼疾病

以上论述说明Notch对骨重建过程起重要调节作用，在骨骼的生长发育中发挥关键作用，Notch基因的获得性及丧失性突变能够造成多种重要的骨骼疾病。Adams-Oliver综合征(AOS)是一类表现为先天性皮肤发育不良伴有颅骨缺损、指(趾)残缺，部分掌骨缺如等临床症状的骨骼系统罕见疾病[47]。Stittrich等[48]发现AOS的大多数基因突变发生在细胞外结构域的EGF样重复序列中，导致其结构改变和Notch1功能缺失。Alagille综合征是一种常染色体显性遗传病，以颅面骨骼和椎骨发育异常、胆汁淤积性肝病、肾功能衰竭等为特征[49]，研究发现其发病与Jagged1基因丧失性突变关系密切[50]，而该病患者肾脏发育不良及功能不全与Notch2基因丧失性突变有关[51]。短指症(Brachydactyly) 是以指骨短、缺失或掌骨变短致使手指、脚趾短为特征的遗传性疾病[52-53]，有研究[54]表明Notch信号的过度活化是造成该疾病的重要原因。Hajdu-Cheney综合征(HCS)是一种罕见的遗传疾病，其特征在于指/趾骨远端骨质溶解、变形以及骨骼，牙齿和关节的发育缺陷，导致颅面和颅骨特异性改变、骨质疏松和身材矮小[55-56]，Canalis等[57]的研究发现HCS患者骨质溶解及改变与Notch2过度激活、Notch2 NICD与NfκB共同诱导破骨细胞前体中的Nfatc1，刺激破骨细胞分化有关。骨肉瘤作为最常见的原发性骨恶性肿瘤，决定其发生发展的分子机制尚未完全清楚，最近有研究[58-59]表明Notch2和JAG1在大多数骨肉瘤样品中上调，Notch1和DLL1在一名患者中上调，Notch靶基因，尤其是HEY1和HEY2均在骨肉瘤样品中上调，因此Notch受体和配体可能成为骨肉瘤的治疗靶点。

4 小结

Notch信号通路对骨形成或骨吸收过程的影响并非单一的促进或抑制作用，而是在全身或局部相关因子共同影响下的双向调节，其作用表现为调节成骨细胞和破骨细胞谱系细胞的分化和功能，并在骨骼发育，软骨形成，成骨细胞、破骨细胞生成及功能中起关键作用。Notch信号的双向调节机制对维持细胞稳态和骨重建机制至关重要。有学者认为不同的Notch信号分子发挥不同的调节作用，如在一定条件下，Notch1抑制破骨细胞生成，而Notch2通过与NfκB相互作用诱导Nfatc1和破骨细胞分化[60]；而Yaoting等认为细胞不同分化时期Notch信号发挥的作用不同，在成骨细胞分化的早期阶段，Notch信号的持续激活抑制了BMSC向成骨细胞的分化，导致BMSCs增多和BMSCs向骨细胞分化减少，在成骨细胞分化的晚期阶段Notch信号的持续激活促进成骨细胞分化为骨细胞，导致成骨细胞数目暂时减少和骨细胞数量增加[43]。另外，Notch通路各环节信号分子基因获得性及丧失性突变导致各种遗传性疾病伴有显著的骨骼异常表现，则更进一步说明了Notch信号在骨骼发育及骨代谢中的重要作用，深入研究Notch信号通路在调节骨形成-骨吸收中的具体作用机制，对于探索相关骨骼系统疾病的发病机制及治疗新思路具有重要意义。