流行性腹泻病毒5株猪安徽流行株S基因的克隆与序列分析

潘孝成，沈学怀，赵瑞宏，戴 银，胡晓苗，侯宏艳，周学利，张丹俊

（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省畜禽疫病研究中心，合肥 230031）

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属，其可导致猪的一种以水样腹泻、呕吐和脱水为特征的传染病，尤其以哺乳仔猪受害最严重，发病率可达100%，病死率平均为50%，10日龄内哺乳仔猪死亡率可高达90%[1]。PEDV为有囊膜的、不分节段的、单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，编码有纤突（spike,S）蛋白、小膜（smallenvelope,E）蛋白、膜（membrane,M）蛋白和核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白4种主要结构蛋白[2]。PEDVS蛋白对介导宿主中和抗体的产生、免疫介导、特异性受体的结合及促进病毒和细胞膜融合等方面具有重要意义，PEDVS基因在遗传进化上存在较高的变异性，其基因序列的改变会引起其毒力、抗原表位、病毒嗜性和组织细胞培养特性等的改变[3-4]。因此，对猪流行性腹泻地方流行毒株的序列分析，旨在了解PEDV遗传变异规律以及为疫苗研制和开展有效防控提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2018年8—12月在安徽省农业科学院畜牧兽医研究所安徽省畜禽疫病研究中心进行。

1.2 主要试剂、材料

RNAiso Plus试剂、反转录试剂盒、Taq酶、pMD-18T载体等购自TakaRa公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、DH5α、DNA Marker等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪轮状病毒（GARV）的抗原快速检测试剂盒（胶体金试剂）购自BioNote公司。

1.3 病料

病料样品为刮取的肠道黏膜，采自安徽省境内疑似发生猪流行性腹泻的猪场（2013—2017年），发病仔猪临床表现为水样腹泻，肠道出血，用PEDV、TGEV和GARV的胶体金抗原快速检测试剂盒检测，结果为PEDV阳性，TGEV和GARV均为阴性。

1.4 引物合成

根据GenBank中已发表的PEDV的S基因序列，设计了 3 对引物，P1、P2，P3、P4 和 P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，3对引物共扩增基因片段长度约4 600 bp，包含PEDVS基因全长（表1）。

表1 引物序列

1.5 RNA提取及cDNA合成

刮取发病仔猪小肠黏膜层，按TakaRa公司RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA，用TakaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit进行反转录合成cDNA，-20℃保存备用。

1.6 PCR扩增

以合成的cDNA为模板，用引物对P1/P2、P3/P4或P5/P6进行PCR扩增，扩增体系为：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 15 μL，扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55℃ 50 s，72℃ 2.5 min，31个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。电泳鉴定为阳性的PCR产物，按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转入DH5α，鉴定的阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 基因序列分析

采用 DNA Star、DNAMAN、Genetyx 等软件，将扩增序列与GenBank中的11个PEDV分离株的S基因序列进行序列比对、同源性分析和遗传进化分析。所用参考毒株序列见表2。

表2 参考株相关信息

2 结果

2.1 RT-PCR扩增和测序结果

取PEDV胶体金抗原检测试剂检测为阳性的，且来自安徽省不同地区5个猪场的样品用3对引物分别进行进行PCR扩增，电泳结果显示，3对引物扩增的基因片段大小均约为1 500 bp（图1），与预期结果相符。测序结果显示，获得5株PEDV流行毒株的S基因序列，序列全长均为4 161个核苷酸，编码1 386个氨基酸，将它们分别命名为AH-CS、AHSC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH。

图1 PEDV S基因PCR扩增结果

2.2 PEDV S基因核苷酸同源性分析

将本试验得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）与参考毒株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CHJXJA-2017、CHS、LZC、attenuated DR13、IA1、USAColorado-2013、MEX-GTO-2014、CV777） 进行S基因核苷酸序列同源性分析，结果见图2。结果显示，5株安徽地方流行毒株S基因核苷酸序列之间的同源性为98.7%～99.8%，与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）序列同源性较低，为93.6%～94.4%；与2011年后的我国分离株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017）、美国分离株（IA1 、USA-Colorado-2013）和墨西哥分离株（MEX-GTO-2014）序列同源性较高，为98.1%～99.8%。

图2 PEDV S基因核苷酸序列同源性分析

2.3 PEDV S基因遗传进化分析

将本试验得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）与参考毒株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CHJXJA-2017、CHS、LZC、attenuated DR13、IA1、USAColorado-2013 、MEX-GTO-2014、CV777）的S基因核苷酸序列进行系统进化树分析，结果见图3。进化树分为G1和G2两个群，G2又被分为G2a和G2b两个分支，经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2010年前我国分离株（LZC和CHS）组成G1群，本试验分离5株安徽地方流行株均在G2群，其中 4株（AH-CS、AH-SC、AH-NY 和AH-SH）与我国分离株（AH2012、CH-SDLY-1-2012）在 G2b 群，AH-LY与中国分离株（CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017）、美国分离株（IA1、USA-Colorado-2013）和墨西哥分离株（MEX-GTO-2014）在G2a群。

图3 PEDV S基因的核苷酸序列进化树

2.4 PEDV S 基因序列分析

将本试验得到的5株安徽地方流行毒株（AHCS、AH-SC、AH-LY、AH-NY 和 AH-SH）与参考毒株（AH2012和CV777）的S基因氨基酸序列比对发现，这5株安徽流行毒株氨基酸序列与AH2012高度相似，仅存在6～19个氨基酸的不同；与参考的经典毒株CV777相比，均存在较大差异，存在94～106个氨基酸位点的突变，其中均存在5个氨基酸（58～59位之间插入氨基酸QGVN，135～136位之间插入氨基酸N）的插入和2个氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸DI）；氨基酸突变位点主要集中在S1区（1～789aa），占S基因总突变位点的75.47%～81.00%。

3 讨论

猪流行性腹泻病毒的S基因是其基因组中的关键毒力基因，PEDV变异主要集中在S基因上，其遗传变异往往造成毒株毒力和抗原表位等的改变。本研究获得了5株PEDV安徽流行毒株的S基因全长序列，序列全长均为4 161个核苷酸，编码1 386个氨基酸，序列比对结果显示，5株PEDV流行毒株的S基因核苷酸序列高度同源（98.7%～99.8%），与2011年后的国内外分离株（AH2012、CH-SDLY-1-2012、CH-weishi-2016、CH-JXJA-2017、IA1、USAColorado-201、MEX-GTO-2014）序列同源性较高，为98.1%～99.8%；与经典毒株（CV777）、疫苗株（attenuated DR13）和2011年前我国分离株（LZC和CHS）序列同源性较低，为 93.6%～94.4%；另外，与 CV777相比，均存在5个氨基酸（58～59位之间插入氨基酸QGVN，135～136位之间插入氨基酸N）的插入和2个氨基酸的缺失（158～159位缺失氨基酸DI）；序列进化分析也表明，5株PEDV分离株与经典毒株、疫苗株和2011年前我国分离株的亲缘关系较远。这与毛黎红等、陈慧娟等、王隆柏等、吴旺霞等、王飞等的研究结果一致[5-10]。综上推测，2011年以来我国PEDV主要流行毒株有相同的毒株来源，且较之前发生了较大的变异；2011年至今中国PEDV流行毒株无较大差异，且与2011年后世界各国的主要流行毒株同源性较高、亲缘关系较近。但2011年后世界各国主要流行PEDV毒株的来源仍需进一步研究。

2010年底开始，猪流行性腹泻在我国呈暴发性流行，2011—2012年流行面积进一步扩大，疫情继续蔓延，一些地区流行较为严重[11-13]，2013年、2014年猪流行性腹泻更是肆虐全球[14-15]，给世界养猪生产者造成巨大的经济损失。虽然近年来我国猪流行性腹泻疫苗的使用较为广泛，但猪流行性腹泻在我国发生呈现常态化，在秋、冬、春季十分常见，其危害仍然十分严重[16]，这可能与 2011年后我国猪流行性腹泻主要流行毒株较以往毒株和疫苗株出现了较大变异有关，这就需要开展猪流行性腹泻防控时，不但要做好生物安全，同时要选择合适的疫苗进行免疫。