PDR患者视网膜前膜中miR-126和VEGF的表达及意义

金 益 卢珊珊 牟晓月

增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是糖尿病的严重并发症之一，糖尿病性视网膜损害刺激视网膜新生血管生成，引起纤维增殖，严重者可牵拉视网膜导致视网膜脱离，导致患者视力严重下降甚至失明[1]。miR-126位于内皮细胞分泌的表皮生长因子样结构域7中，多项研究证实，miR-126在角膜新生血管等新生血管类眼科疾病中发挥重要调控作用[2,3]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能够特异性地作用于内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成，是重要的促血管内皮细胞生长因子[4]。本研究通过检测PDR患者视网膜前膜中miR-126、VEGF表达，探究miR-126与PDR新生血管形成的可能作用机制，现报道如下。

资料与方法

1.一般资料：选择2015年4月～2018年4月在笔者医院眼科行玻璃体切除术的PDR患者80例(80眼)作为研究对象(PDR组)。纳入标准：(1)均为2型糖尿病，符合《中国2型糖尿病防治指南(2013版)》中诊断标准[5]。(2)经眼底荧光血管造影等检查有视网膜新生血管形成、玻璃体积血等。(3)患者及其家属对本研究知情同意。(4)经医院伦理学委员会批准。排除标准：(1)高眼压症、青光眼、角膜新生血管等其他眼部疾病。(2)合并严重心脏、肝脏、肾脏、血液病、免疫系统及代谢系统疾病。(3)无既往眼部手术史、激光治疗史及严重前节屈光间质浑浊。另选择同时期行玻璃体切除术的非糖尿病特发性黄斑裂孔(idiopathic macular hole，IMH)患者50例(50眼)作为对照(IMH组)。

2.视网膜前膜采集：术前控制PDR患者血糖在正常范围，行常规眼压、视力等检查。采用23G三切口玻璃体切除术，剥离视网膜前膜，使用显微镊(广州达美康科技有限公司)取出膜组织。

3.RT-PCR：取视网膜前膜组织，提取膜组织RNA，分别以U6、β-actin为内参对照，RT-PCR检测膜组织中miR-126和VEGF mRNA、CD34 mRNA相对表达量。miR-126引物上游：5′-GGGGTCGTACCGTGAGT-3′，下游：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，VEGF引物上游：5′-AGGGCAGAATCATCACGAAG-3′，下游：5′-GGGAACGCTCCAGGACTTAT-3′，CD34引物上游：5′-CCTGCCGTCTGTCAATGTC-3′，下游5′-GCACTCCTCGGATTCCTGAAC-3′。

4.免疫组织化学染色：将上述视网膜前膜迅速转入10%甲醛固定液中固定10～24h，经不同浓度梯度乙醇脱水后，使用二甲苯置换出膜组织中乙醇，浸蜡后包埋于石蜡中，冷却后，连续切片4mm厚，摊片，70℃烤片1h。组织染色方法：石蜡切片经常规脱蜡、脱水、组织抗原修复及阻断内源性过氧化酶活性后，加入正常山羊血清封闭，室温放置30min后，分别加入稀释过的山羊抗兔VEGF抗体、鼠抗人CD34抗体(上海艾博抗贸易有限公司)，以PBS代替一抗作为对照，4℃下过夜孵育后，室温放置30min，冲洗，加入二抗(上海艾博抗贸易有限公司)，37℃孵育1h，冲洗。DAB染色，苏木素复染，脱水、封片，显微镜下观察、拍照。

5.图像分析：(1)VEGF蛋白分布密度：显微镜下，采用计算机图像采集系统随机采集每个VEGF免疫组化染色切片的3个区域图像，应用Image-proplus 6.0软件分析图像，细胞质或(和)细胞膜呈棕褐色为阳性，选取特定阳性区域，计算阳性区域积分吸光度(integral absorbance，IA)值，以IA平均值代表VEGF蛋白分布密度。(2)微血管密度(microvessel density，MVD)计数：参考韩林峰等[6]方法计数MVD，被CD34抗体染色为棕褐色的单个内皮细胞或细胞簇即为1个微血管计数，组织结构不相连的分支结构也记作1个微血管，排除血管肌层较厚的血管。首先显微镜(×100)下找到微血管最多的区域，然后计数(×200)3个视野的微血管数，取3个视野平均数作为MVD。

结 果

1.两组一般资料：PDR组和IMH组患者性别、年龄、术前眼压等一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)，术前血糖、最佳矫正视力等一般资料比较,差异有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.两组miR-126、VEGF mRNA表达水平：PDR组患者视网膜前膜组织中miR-126相对表达量低于IMH组患者，VEGF mRNA、CD34 mRNA相对表达量高于ROV组患者，两组患者视网膜前膜组织中miR-126、VEGF mRNA、CD34 mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2和图1。

表1 两组一般资料比较

Δ1mmHg=0.133kPa

表2 PDR组和IMH组患者视网膜前膜组织中miR-126、VEGF mRNA表达水平

3.免疫组化：免疫组化染色发现，PDR组患者视网膜前膜中VEGF、CD34均呈阳性表达，IMH组患者视网膜前膜中VEGF、CD34阳性表达较PDR组减少。

PDR组患者视网膜前膜中VEGF IA值为0.031，IMH组患者视网膜前膜中VEGF IA值为0.016，PDR组患者视网膜前膜中VEGF IA值显著高于IMH组患者(t=11.619，P=0.000)。200倍显微镜下计数，PDR组视网膜前膜MVD为5.82～10.31个，平均MVD为8.06±1.57个，IMH组MVD为1.96～5.87个，平均MVD为3.91±0.82个，PDR组患者视网膜前膜MVD显著高于IMH患者(t=4.058，P=0.015),详见图2。

图1 miR-126、VEGF mRNA、CD34 mRNA相对表达量与IMH组比较，*P<0.05

图2 PDR组患者视网膜前膜中VEGF免疫组化(×400)A.PDR组VEGF蛋白表达；B.IMH组VEGF蛋白表达；C.PDR组CD34阳性细胞；D：IMH组CD34阳性细胞

4.PDR组miR-126、VEGF的关系：PDR组患者视网膜前膜组织中miR-126与VEGF表达水平呈显著负相关(r=-0.543，P=0.014)，与CD34表达呈显著负相关(r=-0.730，P=0.000)；PDR组患者视网膜前膜组织中VEGF与CD34表达水平呈显著正相关(r=0.571，P=0.005)，详见图3。

讨 论

图3 miR-126、VEGF、CD34的相关性分析

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是由持续性高血糖引起的一种慢性、进行性危害视力的视网膜微血管病变，PDR以视网膜出现新生血管形成为主要特征，对患者视力危害更大[7,8]。研究表明，miR-126表达下调可能与糖尿病患者内皮损伤有关，并通过介导内皮功能损伤参与糖尿病血管并发症发生[9]。

动物实验表明，DR小鼠内皮细胞和视网膜周细胞中miR-126表达明显降低，IRS-1明显升高，而过表达miR-126可明显抑制内皮细胞和视网膜周细胞侵袭和生存能力，抑制IRS-1及PI3K/AKT通路蛋白表达，提示miR-126在DR发生中具有重要调控作用，可能是DR的潜在治疗靶点[10]。CD34抗原一种与新生小血管相关的阶段特异性白细胞分化抗原，选择性地表达与人类血管内皮细胞、祖细胞表面，在新生血管内皮细胞中表达量远高于非新生血管内皮，是最稳定、敏感且特异性的新生血管内皮标志物[11,12]。本研究显示，PDR患者视网膜前膜组织中miR-126相对表达量显著低于对照组，VEGF mRNA、CD34 mRNA相对表达量显著高于对照组，免疫组化观察发现，PDR组患者视网膜前膜中VEGF、CD34阳性表达多于对照组，PDR组VEGF蛋白分布密度及MVD均显著高于对照组，说明PDR患者新生血管增多。

DR病理改变包括视网膜基膜增厚、毛细血管闭塞、血-视网膜屏障破坏及新生血管生成等，毛细血管闭塞可导致视网膜局部缺氧，引发VEGF等促进组织血管生成因子的产生，进一步促进新生血管生成，使DR发展成为PDR[13,14]。VEGF参与DR的发病机制包括：①糖代谢的多元醇通路异常激活可进一步激活VEGF基因，促进DR病程进展；②高糖可激活蛋白激酶C途径，通过上调VEGF，促进新生血管形成，促进DR进展为PDR；③糖基化终末产物(AGEs)过量产生促进VEGF分泌，增加视网膜毛细血管通透性；④VEGF促进慢性炎症过程，进一步损害视网膜内皮细胞[15，16]。多项研究证实,VEGF是miR-126的靶基因，两者在促进新生血管生成、维持血管完整性等过程中存在调控作用。如Chen等[17]研究证实，过表达miR-126可以通过负调控VEGF-A信号，抑制胃癌肿瘤生长和肿瘤血管生成。另有研究表明，miR-126在风湿性关节炎中低表达，促进成骨细胞中VEGF表达，增加内皮细胞血管生成，而过表达miR-126则有相反效果[18]。

本研究显示，PDR患者视网膜前膜中miR-126表达水平与CD34呈显著负相关，而VEGF表达水平与CD34呈显著正相关，说明视网膜前膜中miR-126、VEGF表达水平与新生血管生成有关。PDR患者视网膜中VEGF表达异常增高，诱导大量新生血管生成，手术治疗中极易出现活动性出血而影响手术成功率。近年来临床实验表明，抗VEGF治疗抑制新生血管活动性，可有效提高手术成功率[19]。本研究表明，PDR患者视网膜前膜中miR-126表达水平与VEGF呈显著负相关，推测miR-126和VEGF在PDR新生血管生成中存在调控机制，通过干扰miR-126表达，可降低视网膜前膜中VEGF表达，对PDR病情发展起抑制作用，且有助于提高PDR治愈率及术后视力恢复。

综上所述，PDR患者视网膜前膜中miR-126和VEGF异常表达，可能是新生血管形成的重要病理机制，在PDR发病及进展过程中发挥重要调控作用，提示miR-126可作为PDR临床治疗的新靶点。但miR-126和VEGF在视网膜前膜新生血管形成的具体调控途径有待于进一步探究。