成纤维细胞生长因子-21通过抑制EMT改善糖尿病肾纤维化

翁晓璐 林孙东 倪永青 何露露 卢学勉

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的并发症之一。据统计，大约40%的DN患者都会发展为终末期肾病(ESRD)[1,2]。进行性的肾脏纤维化过程是DN的发展特点，基质蛋白的过表达导致的细胞外基质(ECM)的过度积累是其重要原因，其中结缔组织生长因子(CTGF)，纤连蛋白1(FN1)和胶原蛋白(Col)都参与了这一过程[3,4]。研究表明，ECM沉积主要由上皮-间质转化(EMT)诱导，EMT是一种上皮细胞转分化为运动间充质细胞的过程，上皮细胞在维持正常肾结构和功能中起重要作用[5]。在EMT期间，上皮细胞逐渐失去顶端-基底极性后和细胞内粘连，同时获得间充质细胞表型。该过程的特点表现在特异性上皮蛋白表达降低，包括E-钙黏蛋白(E-cadherin)和紧密连接蛋白-1(ZO-1)，随后是间充质特异性蛋白的表达增加，包括α-平滑肌肌动蛋白(α- SMA)、波形蛋白(vimentin)和层粘连蛋白(laminin)。此外，有研究表明，抑制肾脏中EMT可显著改善肾纤维化并且遏制DN的发展[5]。

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor, FGF21)是一种重要的代谢调节因子，研究报道FGF21在多种糖尿病并发症中发挥了有益的生物学效应[6,7]。 本课题组前期研究发现，FGF21干预能有效预防1型和2型糖尿病诱导的早期肾细胞凋亡及后期DN[4]。虽然在前期研究中发现FGF21干预能抑制糖尿病肾脏中CTGF的表达，但CTGF只是分子层面表征肾纤维化的多种标志物之一。仅以此为基础推断FGF21在DN小鼠的肾脏中发挥抗纤维化作用，结论不充分。因此，本研究通过多次小剂量STZ腹腔注射诱导1型糖尿病并制备糖尿病肾脏纤维化模型用以考察FGF21干预能否通过抑制EMT过程，降低肾脏中ECM过度积聚，最终预防1型糖尿病DN肾纤维化的发生，以此为防治1型DN找到新的分子机制。

材料与方法

1.材料与试剂：C57BL/6J小鼠购自南京大学模式动物研究所,STZ购自美国Sigma公司，FGF21购自温州医科大学药学院，血清和尿液肾功能试剂盒分别购自美国BioAssay Systems公司和美国BioAssay Systems公司，抗体结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白1(FN1)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)、胶原蛋白Ⅰ(Col Ⅰ)、胶原蛋白Ⅱ(Col Ⅱ)、胶原蛋白Ⅳ(Col Ⅳ)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、磷酸化钙黏蛋白(p-cad)、足细胞裂孔膜蛋白(nephrin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)及层粘连蛋白(laminin)均购自美国Cell Signaling公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，Nanodrop 2000光谱仪由美国Thermo Fisher Scientific提供，Stratagene MX3000p热循环仪由美国Agilent StrataGene公司提供，反转录试剂盒购自美国PE Applied Biosystems公司。

2.实验动物分组及处理：32只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为:正常对照组(Con组)、FGF21组(FGF21组)、糖尿病组(DM组)和治疗组(DM/FGF21组)。连续5日利用链脲佐菌素(STZ)(溶于10mmol/L 柠檬酸盐缓冲液，pH值4.5)多次小剂量(50mg/kg)腹腔注射DM组和DM/FGF21组小鼠，最后一次注射后7天尾静脉取血，检测血糖水平，超过250mg/dl即认定成模，对照组注射相同体积的溶媒(柠檬酸盐缓冲液，pH值4.5)。成模后按分组给予FGF21腹腔注射处理4个月[100μg/(kg·d)]。记录小鼠血糖和体重。 处死小鼠后，收集血清后检测各组小鼠胫骨长、肾重、肾功能水平、肾脏纤维化情况、与ECM相关纤维化指标以及EMT生物标志物的表达水平。

3.肾功能检测：成模4个月后使用代谢笼收集小鼠24h尿液，收集后的尿液于1400r/min离心15min(4℃)，分离保存上清，并记录相应体积。应用试剂盒对尿液及处死小鼠后收集的血清检测多项肾功能指标包括尿蛋白、尿微量白蛋白、尿肌酐、尿蛋白、尿微白蛋白、血清肌酸酐，血尿素氮及尿白蛋白/尿肌酐。

4.组织学染色：将小鼠肾组织在室温下于10%甲醛溶液中固定48h。脱水后进行石蜡包埋，切成4mm厚的块，根据说明书，用苏木精-伊红(HE)染色进行一般形态学检查，糖原(PAS)染色评估肾小球硬化，天狼星红(Sirius Red)染色和Masson三色染色评估代表纤维化的胶原蛋白的累积[7～9]。

5.RNA分离和定量QPCR的检测：使用TRIzol试剂从肾组织分离总RNA，Nanodrop 2000光谱仪定量每个样品中总mRNA的浓度后，按照反转录试剂盒说明书将mRNA样品反转录成cDNA，再用QPCR定量各纤维化指标的表达水平，通过比较CT方法计算mRNA的量。

6.Western blot法检测：将肾组织在裂解缓冲液中匀浆，随后4℃，12000×g离心15min，留取上层清亮部分。在10%SDS-PAGE电泳上分离每个等量蛋白质的样品并电流转膜至硝酸纤维素膜上。在室温下，膜于脱脂牛奶中封闭1h后，在4℃下一抗孵育过夜：CTGF、FN1、PAI-1、ColⅠ、Col Ⅱ、Col Ⅳ、E-cadherin、p-cad、nephrin、ZO-1、α-SMA、vimentin、laminin 在含有0.05%Tween 20的Tris缓冲盐水中洗涤3次后，将膜在室温下二抗孵育1h。最后，发光液曝光并使用Quantity One软件进行灰度分析。

结 果

1.FGF21干预改善肾脏肥大及肾脏功能紊乱：糖尿病小鼠肾脏重量与胫骨长度的比率显著增加，糖尿病组小鼠尿量、尿蛋白含量、血肌酐水平、尿微量白蛋白水平、血尿氮水平和尿白蛋白/尿肌酐比率均增加。但给予FGF21干预后可显著改善肾肥大和肾脏功能紊乱(表1)。

表1 FGF21干预对DN小鼠肾功能的影响

与Con组比较，*P<0.05;与DM组比较，#P<0.05

2.FGF21干预可改善糖尿病肾脏的肾小球硬化和纤维化：苏木精-伊红染色(HE染色)和糖原染色(PAS染色)结果显示，糖尿病组小鼠肾脏病理改变明显，表现为肾小管萎缩、肾小管间质病变、肾小球扩张、肾小球硬化、系膜细胞及基质增生、系毛细血管扩张，而FGF21干预4个月后显著保护糖尿病小鼠肾脏的结构。此外，天狼星红染色和Masson染色显示，糖尿病组小鼠肾小球和肾小管中明显的胶原蛋白积聚，而4个月的FGF21干预抑制了糖尿病诱导的肾纤维化,详见图1。

图1 FGF21干预对DN小鼠肾脏病理改变和纤维化的影响(×200)A.苏木精-伊红染色;B.糖原染色;C.天狼星红染色；D.Masson染色。A～D显示肾小球硬化和胶原沉积，黑色箭头表示上述病理改变；E.系膜基质参数；F.天狼星红染色分析参数；G.Masson染色分析参数。E～G分别为对糖原染色、天狼星红染色和Masson染色切片进行肾小球硬化和胶原蛋白累积的半定量分析。与Con组比较，*P<0.05;与DM组比较，#P<0.05

3.FGF21干预抑制肾脏中ECM累积相关的糖尿病肾纤维化：糖尿病组小鼠的CTGF(ECM合成的强诱导物)的表达以及经典基质蛋白的表达，包括FN1，Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原和Ⅳ型胶原均显著增加，且被认为是炎症和纤维化标志物的PAI-1的表达也明显上调。此外，QPCR测定显示，糖尿病组中上述ECM标志物的mRNA水平也增加。 而在FGF21干预4个月后显著抑制了糖尿病肾脏中ECM mRNA和蛋白质表达(P<0.05，图2)。

图2 FGF21对糖尿病肾脏中ECM和肾纤维化标志物的mRNA表达的影响A～D为肾脏中ECM沉积相关的经典标志性蛋白表达水平(A.FN1;B.Col Ⅰ;C.Col Ⅱ;D.Col Ⅳ)。E、F为肾纤维化和炎性反应的多种标志物的蛋白表达水平(E.CTGF；F.PAI)。G～L为通过qPCR获得的上述标志物相应mRNA水平(G.FN1；H.Col Ⅰ；I.Col Ⅱ；J.Col Ⅳ；K.CTGF；L.PAI)。与Con组比较，*P<0.05;与DM组比较，#P<0.05(n=8)

4.FGF21抑制糖尿病肾脏中的EMT。如图3所示，糖尿病组小鼠的EMT显著增强(P<0.05)，体现在E-cadherin和ZO-1的表达降低，而间充质细胞标志物的表达增加，包括α-SMA、vimentin和 lamini。通过FGF21干预4个月后，抑制了上述EMT过程(P<0.05)。FGF21诱导的糖尿病肾脏对EMT的预防作用与抑制负转录调节因子Snail、Twist和Slug有关。在治疗组中，来源于足细胞的P-cadherin的在肾脏中表达上调(P<0.05)，而糖尿病组中Nephrin表达在肾脏中明显下调(P<0.05)。

图3 FGF21对DN小鼠肾脏中EMT过程的表达的影响A～C为E-cadherin的负转录调节因子的蛋白表达水平(A.Snail；B.Twist；C.Slug)。D～I为EMT过程的间充质细胞标志物蛋白表达水平(E.E-cadherin；F.ZO-1；G.α-SMA；H.vimentin；I.Laminin)。J、K为来源于肾小球的黏附蛋白表达水平(J.P-cadherin；K.Nephrin)。与Con组比较，*P<0.05;与DM组比较，#P<0.05(n=8)

讨 论

FGF21是FGF家族的成员，其在多个器官中以内分泌方式发挥有益生物学作用[10]。 越来越多的临床研究表明，患有各种肾病包括慢性肾病(CKD)、肾移植、ESRD、早期糖尿病肾病以及急性肾功能不全在内的患者血液循环中的FGF21水平显著增加，表明FGF21高于基础水平是肾脏保护的一种应激反应[11～16]。该结论研究显示在患有CKD的小鼠中给予FGF21可维持肾功能。前期研究证实FGF21给予可预防DN，但FGF21缺失会加速DN的进展[9,17]。笔者还发现FGF21干预抑制糖尿病肾脏中的CTGF表达[18]。 然而，CTGF只是纤维化标志物之一，以此为基础推断不足以说明FGF21在DN小鼠肾脏中的抗纤维化作用，因此，需要进行进一步机制探索。

本研究采用多次小剂量(50mg/kg)在小鼠腹腔注射STZ的方法建立1型糖尿病模型。确定成模4个月后，小鼠出现肾功能受损和形态学异常，其特征为肾小管萎缩、肾小管间质病变、肾小球扩张、肾小球硬化、系膜细胞和系膜基质增生、及毛细管扩张、塌陷。同时，在天狼星红染色和Masson染色发现，纤维化也明显出现在肾小管和肾小球区域。通过糖原染色发现，在DM中肾小球硬化十分明显。上述结果表明在糖尿病肾脏中，肾小管和肾小球均发生纤维化。此外，糖尿病肾脏中多种纤维化指标的上调和ECM标志物表达水平的增加也进一步证实了肾脏纤维化的演变。然而，通过4个月的FGF21干预显著抑制了上述所有现象，表明FGF21在DN小鼠的肾中发挥了抗纤维化作用。

研究表明，EMT在肾脏硬化和ECM积聚中起着重要作用，这是糖尿病肾病的标志[5]。EMT可根据其发生的不同生物环境和相关结果分为3种不同类型， 1型EMT发生在胚胎开始和器官发育期间，这是器官重塑和器官进化所必要的过程，并且它的发生不诱导炎症、纤维化和恶性转移。2型EMT发生能在器官纤维化和组织再生过程，并诱导活化间充质细胞的产生、刺激ECM积聚，最终导致组织损伤。3型EMT一般在肿瘤进展和转移期间发生，并且与肿瘤转移所需的癌细胞基因组和染色体的变化相关。而在糖尿病肾病中EMT属于2型EMT，其被认为是糖尿病肾纤维化的诱导物。本研究结果显示，糖尿病肾脏中上皮细胞标志物E-cadherin和ZO-1的表达下降，以及间充质细胞标志物α-SMA、Vimentin、Laminin表达的上调，表明在糖尿病肾脏中EMT过程活跃。同时，肾小球中的EMT在诱导足细胞丢失和肾小球损伤方面也起着重要作用[19,20]，在本研究中观察到足细胞的特异性标志物p-cad和Nephrin的表达降低。而所有上述EMT标志物的表达通过给予FGF21可得到反向有益调节，表明FGF21在糖尿病肾病的肾小管和肾小球中对EMT的发挥抑制作用。

综上所述，FGF21干预能通过抑制上皮细胞间充质转化的过程，减少细胞外基质在肾内的积聚，从而减轻糖尿病导致的肾脏纤维化，为防治1型DN提供了新的理论依据。