结肠癌Galectin-3、P53和MSH2蛋白表达水平与临床病理特征及预后的相关性分析

张 羽，时妍妍

（辽阳市中心医院病理科，辽宁 辽阳111000）

结肠癌是全球发病率较高且预后较差的肿瘤之一。我国是结肠癌高发国家，2015年我国结肠癌发病率占全球24.3%，死亡数占全球22.9%［1］。近年来，随着人们饮食习惯的改变，我国结肠癌的发病率呈上升趋势，对人类健康构成了巨大的威胁。结肠癌早期临床症状不典型，许多患者在就诊时已发展至晚期。尽管结肠癌的治疗已有较大进展，但其预后仍不尽如人意，结肠癌患者五年生存率约为48.8%［2］。蛋白质组学技术在对实体肿瘤的分子标志物检测中显示出了特有的高灵敏度、特异性，并在肿瘤预后评估中扮演重要价值。近期研究指出，半乳糖凝集素3（Galectin-3）、肿瘤蛋白p53（protein 53，P53）和MutS蛋白同系物2（MutS homologs 2，MSH2）等蛋白异常表达与多种癌症的发生及转移密切相关［3-5］。然而，关于Galectin-3、P53和MSH2在结肠癌患者组织中的表达及与临床病理特征和预后的相关性尚未见报道。本研究通过分析结肠癌患者组织中Galectin-3、P53和MSH2表达水平，探究三者对结肠癌的临床价值。

材料和方法

1 研究对象的纳入

收集本院2016年1月到2018年1月进行结肠癌手术的结肠癌组织及癌旁组织共140对，于-80℃冰箱保存备检测。癌旁组织取自同一患者距离癌组织边缘2 cm。所有纳入对象经术后病理切片明确诊断。结肠癌的诊断和分期依据2013年美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南第三版［6］。患者中位年龄为51岁，年龄分布为34～65岁，平均年龄为49.8±6.7岁。其中男性98例，女性42例；Ⅰ～Ⅱ期患者96例，Ⅲ～Ⅳ期患者44例；腺癌107例，粘液癌18例，未分化癌15例；高分化癌56例，中分化癌60例，低分化癌24例。纳入标准：①语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；②研究对象自愿参与本研究。排除标准：①既往有其他肿瘤疾病史者；②排除脑卒中、老年痴呆等神经系统疾病导致的无法采集相关信息和精神分裂症的患者。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

2 随访

从患者手术完成开始对纳入的140例结肠癌患者进行42个月电话随访，随访日期截止至2018年7月，记录患者的生存时间。随访终点为：①42个月内患者死亡；②42个月内患者退出该项研究；③42个月随访结束。

3 免疫组织化学法检测与免疫染色定量

取结肠癌患者的病理石蜡切片标本，室温封闭40min（5%血清），加入单克隆抗体Galectin-3、P53和MSH2，碱性磷酸酶二抗4℃孵育。磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后分别加入链霉亲和素-过氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）和二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）恒温显色封片。抗体均购于Abcam公司。用10×目镜、40×物镜显微镜进行观察。应用Image Pro Plus对免疫组化结果进行分析，并按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分（immunohistochemical scores，IHS）。HIS＝a×b，a代表阳性细胞百分比：a＝0，无阳性细胞；a＝1，阳性细胞为1%～10%；a＝2，阳性细胞为11%～50%；a＝3，阳性细胞为51%～80%，a＝4阳性细胞所占比例达81%以上。b代表阳性细胞染色强弱：b＝0，阴性；b＝1，弱阳性；b＝2，中度阳性；b＝3，强阳性。

4 Western blot检测蛋白Galectin-3、P53和MSH2含量

取16对结肠癌组织及癌旁组织冰上裂解2h，制备细胞总蛋白（Proteo Prep®总蛋白提取试剂盒），并测量蛋白浓度。常规恒流进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移的方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，以Galectin-3、P53和MSH2单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠或抗兔IgG抗体为二抗，用电化学发光（enhanced chemiluminescent，ECL）显色剂显色，对各组蛋白泳道条带进行灰度扫描分析，检测Galectin-3、P53和MSH2蛋白的表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参照。抗体均购于Abcam公司。实验过程严格按照试剂说明书进行。

5 统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布资料以均值±标准差（）表示，两组和多组间比较分别采用独立样本t检验和单因素方差分析。率的比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearman检验。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，应用对数秩检验（log-rank test）计算生存曲线间的统计学差异。本研究检验水准设为α＝0.05。

结 果

1 Galectin-3、P53和MSH2免疫组织化学结果

如表1和图1所示，与癌旁组织相比，结肠癌组织中Galectin-3、P53和MSH2蛋白免疫组化染色强度增高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 Galectin-3、P53和MSH2蛋白的免疫组化评分（分，）

表1 Galectin-3、P53和MSH2蛋白的免疫组化评分（分，）

分组 例数 Galectin-3 P53 MSH2癌组织 140 9.76±0.41 7.54±0.27 8.31±0.31癌旁组织 140 3.14±0.26 3.14±0.18 2.54±0.16 t值 7.532 4.053 6.683 P值 ＜0.001 0.012 ＜0.001

图1 Galectin-3、P53和MSH2免疫组织化学检测结果（400×）

2 结肠癌组织及癌旁组织中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表达水平

取16对结肠癌组织及癌旁组织应用WB技术检测蛋白表达水平，如表2和图2所示，相比于癌旁组织，结肠癌组织中Galectin-3、P53和MSH2蛋白表达水平增高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 结肠癌组织及癌旁组织中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表达水平（）

表2 结肠癌组织及癌旁组织中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表达水平（）

分组 例数 Galectin-3 P53 MSH2癌组织 16 6.78±0.71 6.01±0.62 6.32±0.59癌旁组织 16 1.98±0.28 1.03±0.14 1.84±0.24 t值 6.480 9.034 5.863 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

图2 结肠癌组织及癌旁组织中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表达水平

3 Galectin-3、P53和MSH2蛋白免疫组织化学检测水平与结肠癌临床病理特征的关系

Galectin-3、P53和MSH2免疫组织化学水平与结肠癌患者的年龄、性别和组织学类型等因素均无相关 性 （P＞0.05），而 与 结 肠 癌 患 者 分 期（Galectin-3：r＝0.567，P＝0.002；P53：r＝0.552，P＝0.006；MSH2：r＝0.535，P＝0.011）和分化程度（Galectin-3：r＝0.514，P＝0.006；P53：r＝0.501，P＝0.018；MSH2：r＝0.497，P＝0.023）呈线性关联，且Galectin-3、P53和MSH2蛋白在Ⅲ～Ⅳ期结肠癌及低分化结肠癌患者中的水平增高最显著，见表3。

表3 Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平与结肠癌临床病理特征的关系

4 Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平与结肠癌预后

经42个月随访，共33例患者死亡，0人失访。140例结肠癌患者分别依据免疫组织化学检测的Galectin-3、P53和MSH2水平的中位数分为高Galectin-3与低Galectin-3组、高P53与低P53组和高MSH2与低MSH2组。相比低Galectin-3组，高Galectin-3组生存率显著降低（χ2＝8.436，P＝0.004，图3-A）；相比低P53组，高P53组生存率显著降低（χ2＝4.481，P＝0.034，图3-B）；相比低MSH2组，高MSH2组生存率显著降低（χ2＝13.830，P＜0.001，图3-C）。

图3 Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平与结肠癌预后

讨 论

结肠癌患者肿瘤组织生长迅速，病程进展不易控制，是预后较差的肿瘤之一。由于目前尚无有效的靶向治疗药物，手术治疗仍是结肠癌的主要治疗手段。虽然近年来关于结肠癌的临床诊疗技术得到了显著提高，但其患者的五年生存率仍维持在较低水平。研究指出，蛋白质组学技术的分子检测对于肿瘤的预后评估具有较大应用前景，本研究就Galectin-3、P53和MSH2等三个蛋白质分子在结肠癌和癌旁组织中的差异表达分析，旨在找寻结肠癌预后评估的有效分子标志物。

近年来，关于Galectin-3与癌症间关系在国内外已有多个研究报道。LIU等［7］发现在乳腺癌细胞系中过表达Galectin-3可通过线粒体途径抑制肿瘤细胞凋亡，并认为Galectin-3是一种新的乳腺癌风险生物标志物。LEI等［8］的研究发现，miR-107可通过靶向作用于Galectin-3，进而抑制Galectin-3的转录后翻译，以抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力。上述研究提示，Galectin-3的差异表达通过干扰多种生物学行为参与肿瘤的发生、发展过程。关于Galectin-3与结肠癌间的关联研究也有报道。王健宝［9］分析肠癌患者血清中Galectin-3与临床分期及淋巴转移的关系发现，Galectin-3与肠癌患者临床分期及分化程度有关，且随着肠癌患者临床分期的增加及分化程度的升高，血清Galectin-3的表达显著增强。上述研究提示Galectin-3参与结肠癌的进程，然而关于Galectin-3蛋白表达与结肠癌患者预后的分析尚不明确。p53基因是人体重要的抑癌基因，但报道指出多种癌症细胞内p53基因会发生突变而丧失细胞基因修复功能。王晴等［10］指出p53基因是膀胱癌组织中显著增高，且高表达的p53蛋白与患者的不良预后相关。近期，PHERMTHAI等［11］的研究发现，癌基因长链非编码RNA H19可扮演竞争性内源核糖核酸而抑制miR-29表达，进而降低miR-29对p53基因表达的抑制功能，促进上皮间质转化及癌细胞转移。近期，温玉婷等［12］对121例结肠癌患者癌组织中P53的表达及与临床病理特征相关性的分析指出，p53在癌组织中的阳性率显著高于癌旁组织，且p53水平随着分化程度的减低而逐渐增高，并提示p53水平增高可能与不良预后有关。本研究旨在探讨p53与临床病理特征的基础上进一步探讨其在结肠癌患者预后中的价值。MSH2蛋白是一类重要的错配修复蛋白，潘琦等［13］通过体外培养肝癌HepG2细胞系，并经过表达MSH2于HepG2细胞以上调HepG2细胞中MSH2的表达水平，观察到上调MSH2后可显著上调下游促癌靶基因Krüppel样因子4的表达，进而促进HepG2细胞的增殖与迁移能力，并抑制癌细胞凋亡，提示MSH2对HepG2细胞的生物学活性具有促进作用。然而，关于MSH2蛋白在结肠癌患者预后评估的价值尚未见探讨与分析。

本研究通过对140例结肠癌组织及癌旁组织的分析发现，与癌旁组织相比，结肠癌组织中Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平显著增高。此外，Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平与结肠癌患者分期和分化程度呈线性关联，且Galectin-3、P53和MSH2蛋白在Ⅲ～Ⅳ期结肠癌及低分化结肠癌患者中的水平增高最显著，提示三者与结肠癌的不良预后密切相关，该部分结果与前期相关肿瘤生物学的研究结果基本相符［7-13］。生存分析发现，高Galectin-3组、高P53组及高MSH2组患者的生存时间显著短于低Galectin-3组、低P53组及低MSH2组患者，提示结肠癌患者组织中Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平在评估患者预后中具有潜在价值。然而，本研究仍有如下不足：①本研究纳入140例结肠癌患者，纳入的例数仍然是有限的，后期需要更大样本量的研究来证实Galectin-3、P53和MSH2在我国结肠癌患者中的临床价值；②所有研究对象均来源于我院，这可能会造成潜在的选择偏倚。

综上所述，本研究证实了癌组织中Galectin-3、P53和MSH2蛋白的差异表达与结肠癌患者分期和分化程度相关，且Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平对结肠癌患者的预后评估具有重要意义，这些发现有望为结肠癌的临床诊疗提供新的途径。