血红蛋白毛细管电泳和血液学指标在地贫筛查中的诊断价值

孙艳虹，郑 丹，陆雯韻

（中山大学附属第一医院东院检验科，广东 广州510700）

地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，简称地贫，是由于遗传基因缺陷导致血红蛋白肽链的合成部分或完全受到抑制，从而引起的贫血或病理状态的一种血红蛋白病，是一组常染色体不完全显性遗传性疾病。目前世界上尚没有可以治愈地贫的方法，对育龄夫妇和疑似人群进行地贫筛查在一定程度上可以减少地贫患儿的出生或尽早对地贫患者进行治疗。地贫产前诊断技术规范［1］要求采用红细胞分析用于初筛、进一步进行血红蛋白分析，结果异常才进行基因诊断以便确诊。血红蛋白电泳分析方法包括：琼脂糖凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳法、毛细管电泳法。毛细管电泳是近些年来发展起来的一种血红蛋白分析技术，本文拟对血红蛋白毛细管电泳结果结合血液学指标对地贫的筛查效能进行分析，并与基因检测进行对比，探究这两个指标联合检测在地贫筛查中的诊断价值。

材料和方法

1 研究对象

收集2016年1月到2017年7月期间到中山大学附属第一医院东院进行地贫筛查的病例6416例，包括贫血原因待查病人和产检孕妇，其中同时进行血细胞分析、毛细管电泳和基因检测的病例152例，其中男47例，女105例，年龄25天至54岁。

2 仪器和试剂

血液分析采用日本希森美康公司生产的XE-5000血细胞分析仪及配套试剂；血红蛋白电泳采用美国海伦娜公司生产的V8全自动毛细管电泳仪及配套试剂；基因检测由达安公司检测。

3 方法

3.1 标本的采集与处理 采集静脉血2～3mL分置于两管EDTA抗凝的真空采集管，轻微颠倒混匀8次后，分别送检本院检验科及达安公司进行相应检验。

3.2 血细胞参数 采用日本SYSMEX XE-5000全自动血液分析仪及其配套试剂，根据仪器标准操作规程检测患者的红细胞参数，包括MCV、MCH、RBC、HB、HCT等。

3.3 血红蛋白分析 采用美国海伦娜V8全自动毛细管电泳及其配套试剂，根据标准操作规程检测患者的血红蛋白电泳带，并对电泳带中出现的杂带进行剔除，计算出各血红蛋白带的检测值。该方法的精密度良好，变异系数（CV）≤8%，批间差≤8%；灵敏度较高，在Hb浓度≤60g／L和HbA2比例≤1.1%的样本均可分离到清晰的A2区带。

3.4 基因检测 缺失型α-地中海贫血检测：用全血基因组DNA提取试剂盒提取全血DNA，采用跨越PCR技术（Gap-PCR）方法检测-SEA／αα、-α3.7／αα、-4.2／αα3种常见缺失型 α-地中海贫血基因；非缺失型α-地贫和β-地贫基因检测：采用反向斑点杂交法，检测3种α-地贫突变的野生型和突变型，包括Hb CS、Hb WS、Hb QS；采用RDB法检测17种 β-地贫点突变，包括-28、-29、-30、-32、CD14-15、CD17、CD26（βE）、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、IVS-I-1、IVS-I-5、IVS-Ⅱ-654、CAP＋1、initiatiaon condon。严格按照试剂盒说明书操作，观测结果判断基因型。

4 结果判断标准

4.1 红细胞参数 MCV＜82fL、MCH＜27pg；Hb：男 ＜130g／L、女 ＜115g／L，三者中出现一个及以上时，排除缺铁性贫血、自身免疫性溶血、其他血红蛋白生成障碍性疾病，则疑为地中海贫血。

4.2 毛细管电泳 α-地贫：HbA2＜2.5%，或出现HbH、HbBarts、HbCS异常血红蛋白带；β-地贫：HbA2＞3.5%，或出现HbF＞2.0%，或出现异常血红蛋白带；异常血红蛋白病：2.0%＜HbA2＜3.5%，且有其他异常血红蛋白带。

4.3 基因检测 出现相应的基因缺失或点突变。

4.4 筛查结果 红细胞参数和（或）电泳结果异常判读为地贫可疑，筛查阳性；红细胞参数及电泳结果均正常，判读为筛查阴性。

5 统计学处理

采用Excel 2003软件整理数据，采用SPSS19.0软件分析数据。使用单样本K-S检验验证数据是否符合正态分布，服从正态分布的指标采用均值和标准差描述，组间比较采用t检验；不服从正态分布的指标以中位数和四分位范围表示，进行非参数检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。计算单纯血红蛋白电泳筛查、血细胞分析筛查及其联合筛查的灵敏度、特异性、预测值，运用卡方检验计算各种方法是否存在显著性差异。

结 果

1 筛查指标在地贫组和非地贫组的变化

152例病例中，进行K-S检验后得HCT、RBC、HB、MCV、MCH符合正态分布，HbA2不符合正态分布，根据基因检测结果分为地贫组和非地贫组。地贫组HB、MCV、MCH水平明显低于非地贫组，RBC水平高于非地贫组，差异有统计学意义（P＜0.05）；α-地贫的RBC水平高于非地贫组、MCV水平低于于非地贫组，差异有统计学意义（P＜0.05）；β-地贫的HB、MCV、MCH水平低于非地贫组，RBC、HbA2水平高于非地贫组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 地贫筛查指标在地贫组和非地贫组的变化

2 地中海贫血筛查结果

152例患者中检出为疑似地贫患者的符合率为54.1%，检出为异常血红蛋白带者的符合率为80%；检出单纯MCV、MCH或电泳异常者的符合率为14.5%，筛查正常者的符合率达90.9%；筛查总符合率为44.7%，详见表2。

表2 地贫筛查结果

3 地中海贫血基因检测结果

152例病例中，确诊地贫基因携带55例，其中α地贫35例，占63.6%，β地贫19例，占34.5%，α＋β复合地贫1例，占1.8%。基因检测异常的分布见表3。

表3 55例地贫确诊病例基因异常分布

4 地贫筛查试验的诊断效能评估

4.1 各血液学指标的诊断效能 采用ROC曲线计算曲线下面积及约登指数评估常用血液学指标在地贫筛查中的诊断效能。在152份样品中，HB、HCT的曲线下面积分别是0.616、0.519，灵敏度、特异性不高，HCT在正常人与地贫患者中差异无统计学意义；MCV、MCH、RBC的曲线下面积分别是0.838、0.727、0.809，在地贫筛查中灵敏度、特异性均较高，其中MCH灵敏度最高，MCV的特异性最高，均优于RBC，具体结果见表4、图1、图2。

表4 红细胞参数的诊断效能

图1 HB、HCT、MCV、MCH的ROC曲线

图2 RBC的ROC曲线

4.2 不同筛查策略的诊断效能 根据单纯血细胞分析结果、单纯毛细管电泳结果、联合血细胞分析和毛细管电泳结果对比基因检测结果，可知单独血细胞和单纯电泳结果异常对地贫筛查的均有较高灵敏度，但特异性相对较低；以血细胞分析及电泳结果双异常为筛查阳性判别标准时，地贫筛查的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值、阴性预测值均较高。详细见表5、表6、表7、表8。

表5 血细胞分析结果与基因结果比对

表6 电泳结果与基因结果对比

表7 血细胞分析和（或）电泳结果（任一阳性）异常与基因结果对比

表8 血细胞分析结果及电泳均异常与基因结果比对

4.3 单纯电泳筛查与联合筛查对地贫分型的价值 MCV、HbA2在 α-地贫与 β-地贫中差异无统计学意义，MCH在α-地贫与β-地贫中差异有统计学意义；MCV、MCH、HbA2均异常与单纯MCH在 α-地贫、总地贫中有统计学意义，在β-地贫中差异无统计学意义。见表9。

表9 单纯筛查和联合筛查对地贫分型的价值

讨 论

地中海贫血是世界上常见的单基因遗传病，是由于珠蛋白基因缺如或突变引起珠蛋白肽链生成障碍，引起形成α-链与非α-链失衡的一种慢性溶血性贫血。根据珠蛋白肽链失衡的程度和差异，地中海贫血可根据临床症状分为静止型、轻型、中间型、重型几种类型，轻者和静止型患者可与正常人表现无异常，不影响正常生命活动，重型如α-地中海贫血可造成死胎、肿大胎儿，β-地贫患者多生长停滞、终身需要输血及去铁治疗［2］，这对于地贫患者的家庭及社会均是一个沉重的经济及精神负担。但由于地中海贫血的不可治愈性，目前国际上针对地中海贫血的控制方案主要是控制地贫患儿的出生，提高新生人口的质量。根据调查统计显示，地中海贫血在中国南方地区流行，广东、广西、重庆等地区地中海贫血分布广泛，基因携带率高，分别为11.07%、23.98%［3］、13.96%［4］。同时在对新生儿脐带血进行产前诊断的研究中发现，利用血红蛋白电泳进行地贫筛查，其对地贫患者的阳性检出率可达11.89%，但其对β-地贫筛查效果明显低于α-地贫，这就很容易导致β-地贫患儿的漏诊［5］。同时赵芳等［6］在广东地区胎儿的基因型及血液学研究中表明，β-地贫患儿在胎儿期血象表现隐匿，血液学指标与正常对照组差异无统计学意义，所以这也可能导致β-地贫的漏诊，错过对病情进行干预的最佳时机。所以产前筛查在减少地贫患者的出生以及筛查β-地贫患者有着十分重要的作用。

本研究中，152例进行地贫筛查的病例中，共有55例确证为地中海贫血，其中检出α-地贫35例，基因型为SEA缺失杂合子占27例，检出 β-地贫19例，检出α-地贫的阳性率高于β-地贫的阳性率，符合广东地区地贫的发生分布情况，与索明环等［1］、李文瑞等［7］的结果相符，但地贫阳性符合率明显低于李文瑞的关于东莞地区电泳结果的研究。在表2中，我们可以看到152例地贫筛查中，筛查阳性例数为74例，确诊率为54.1%，明显低于李文瑞的α-地贫基因符合率（α-地贫的基因符合率为80.55%，β-地贫的基因符合率为96.77%），这可能与我们仪器的结果判读规则有关。本实验室采用的是血红蛋白毛细管电泳法，采用标本为全血，通过裂解红细胞，再对其血红蛋白进行电泳，检测结果除所需血红蛋白带，还存在很多杂带，这些杂带会对检测的电泳图造成一定的影响，一般显示存在很多不必要的杂交带，甚至出现A2带偏移的情况。这时需要人工对条带进行修整，人为误差存在很大因素，对于一些轻微的异常条带容易忽略，也容易对正常区带判断存在轻微误差而判定为电泳结果异常，导致出现漏诊或误诊情况，使电泳试验准确度下降，准确率为46.1%；在152例样本中，有部分患者的血红蛋白A2带处于2.50%～2.55%，根据本实验室仪器出现过整批次标本血红蛋白带偏低的情况，故人工判读时仍会根据仪器情况将其判定为血红蛋白A2偏低。所以在临床的地贫筛查中，不能仅关注血红蛋白电泳结果，需结合血细胞分析结果进行分析。

但作为分离和定量血红蛋白的一种临床常用方法，血红蛋白电泳仪能检出和确认各种正常和异常的血红蛋白，诊断异常血红蛋白病中有重要诊断意义；毛细管电泳作为一种新的血红蛋白电泳技术，相对于琼脂糖凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳，更能准确区分HbA、HbA2、HbF、HbH、HbBart′s、HbCS等条带，在地贫筛查中效果更佳［8］。在152例患者，异常血红蛋白确诊的符合率达80%，说明毛细管电泳对于异常血红蛋白病的检出有很高的临床价值。在对152例患者进行电泳试验，对比其基因诊断结果可知，其实验灵敏度达85.5%，阴性预测值达71.2%；但实验的特异性仅为23.7%，试验准确度为46.1%，阳性预测值为38.8%，所以电泳异常在筛查地中海贫血患者与非地贫患者中具有一定的诊断价值，但其特异性低，假阳性率高，容易造成患者的不必要心理和经济负担。其中在表1中可以看出，血红蛋白A2带在正常人与α-地贫患者中无明显差异，在正常人与β-地贫患者中差异具有统计学意义，说明当患者为β-地贫患者时，其血红蛋白结果升高更具有临床意义；但其他疾病如缺铁性贫血等同样可出现MCV、HBA2降低，所以α-地贫的试验特异性不高，与非地贫组结果无明显差异；同时由于α-地贫在广东地区中数量较多，当患者为轻型或隐匿性α-地贫时，其血液学指标和血红蛋白A2带均可能表现为正常而导致这部分患者漏诊，从而使准确度下降。根据毛细管电泳灵敏度高的特点，可以把大部分的疑似患者筛选出来，但实验的特异性不高，导致试验的假阳性率也相对较高，许多患者继而进行基因检测，容易增加患者的负担。在表2中，有1例患者筛查结果为疑似β-地贫，基因检测结果为α-地贫合并β-地贫，这可能是由于 α-肽链和β-肽链相对不平衡，比单一的α-肽链或β-肽链的贫血程度有所减轻，从而其典型血象和电泳结果表现为β-地贫，α-地贫表现不明显，从而引起漏诊。这也是毛细管电泳的一个暂时无法解决的缺点。

除了血红蛋白含量检测，地贫作为一种小细胞低色素性贫血，血液学表型变化是地贫患者或者地贫基因携带者的一个显著特征，根据病情严重程度，典型地贫患者其血液学指标异于正常值，典型血象表现为，RBC升高、MCV、MCH降低，同时可伴有其他血液型指标变化。在表1中，根据基因诊断结果分成地贫组与非地贫组，对其进行统计学分析可发现，地贫组HB、MCV、MCH水平明显低于非地贫组，RBC水平明显高于非地贫组，HCT在两组中无显著性差异，说明地贫患者RBC、HB、MCV、MCH水平异于正常人；同时，分别将α-地贫、β-地贫与非地贫组进行比较，可知α-地贫的RBC水平高于非地贫组、MCV水平低于于非地贫组，差异有统计学意义；β-地贫的HB、MCV、MCH水平低于非地贫组，RBC、HbA2水平高于非地贫组，说明血液学指标在两种地贫中的作用不尽相同。为了探究几项血液学指标在地贫筛查作用的差异程度，我们采用受试者工作曲线对152例病例进行曲线下面积计算，探究各个指标的诊断效能及其切值。由表4中可以看出，HCT的曲线下面积仅为0.519，相应灵敏度、特异性为0.436、0.753，试验的诊断效能较低；Hb的曲线下面积为0.616，相应灵敏度、特异性分别为0.673、0.577，试验的诊断效能一般；MCV、MCH、RBC的曲线下面积分别是0.838、0.727、0.809，诊断效能较好，其中MCH灵敏度最高，MCV的特异性最高，均优于RBC。综合表1、表4分析，MCV、MCH在地贫筛查中的诊断意义最高，所以临床上怀疑地贫时更应留意其MCV、MCH两个血液学指标。地贫组与非地贫组比较，MCV、MCH这两个指标差异均存在统计学意义，其均值明显低于正常值，这时可以通过检测MCV、MCH的值来预测患者为地中海贫血。同时这两个指标的约登指数最大时的切值均明显低于标准参考范围，所以实验室可以通过各自实验室的情况来制定适宜的诊断标准。

在表5中，以患者的MCV、MCH指标是否异常作为血细胞分析是否异常的标准，与基因结果进行比对可以发现实验的灵敏度为87.3%、阴性预测值为87.9%，对于排除非地中海贫血患者具有一定诊断价值，但试验准确度为65.1%、特异性为52.6%、阳性预测值为51.1%，确诊地中海贫血的诊断价值不高，这是可能因为地中海贫血患者表现为珠蛋白肽链生成障碍造成血红蛋白生成障碍，表现出RBC升高、MCV、MCH降低的典型血象，同时还可能存在机体对血红蛋白生成障碍进行代偿，表现为红细胞代偿性增多，红细胞计数增加；当机体失代偿时，机体红细胞无法供应正常生理需求，表现为红细胞计数下降［9］。当患者为缺铁性贫血等其他病理性原因导致的贫血时，其血细胞分析结果也可能出现HB、MCV等指标降低，所以试验的特异性不高，需要与其他病理性贫血性疾病进行区分。这时可以对患者进行血清铁试验或检测RDW-CV值，以排除缺铁性贫血等疾病的干扰，可以提高非地贫患者的排除率和地贫患者的检出率。但对于临床要完全排除缺铁性贫血、自身免疫性溶血、其他血红蛋白生成障碍性疾病等疾病仍存在一定的困难，所以单纯依靠血细胞分析结果来判断地中海贫血患者仍存在很大缺点。

对于诊断地贫患者，进行珠蛋白基因分析与蛋白质一级结构的分析，检出氨基酸变异的性质及位置是一种理想的诊断方法，所以基因诊断可作为检测地中海贫血的金指标，但因技术要求高未能广泛开展应用［10］。《广东省卫生产前诊断技术管理实施细则》中明确了地贫产前诊断技术规范，包括了血细胞分析、血红蛋白分析和基因诊断，血细胞分析用于初筛，进一步进行血红蛋白电泳，结果异常这才进行基因诊断以便确诊。但临床上各个医院及机构的筛查手段不尽相同，分析单纯电泳筛查与联合筛查对地贫分型的价值，探究两种筛查手段在我院实验室中的筛选价值有利于我院更好地开展地贫筛查工作。由表8中可见MCV、HbA2在α-地贫与β-地贫中无明显差异，MCH在α-地贫与β-地贫中有显著性差异；MCV、MCH、HbA2均异常与单纯MCH在α-地贫、总地贫中有显著性差异，在β-地贫中无明显差异，所以临床上诊断β-地贫时可主要分析电泳结果，但诊断α-地贫时则需要结合电泳和血细胞分析结果，才能更好地提示地贫筛选的结果。所以临床上主要筛查手段为联合分析血细胞分析结果与电泳结果，筛查结果阳性或可疑者再建议基因检测，来达到地贫筛查的目标。

对比表5、表6、表7、表8，灵敏度最好的筛查手段为以血细胞分析联合毛细管电泳结果任一异常均判为筛查异常，试验的灵敏度可达到96.4%，阴性预测值为81.8%，可以将大多数的疑似地贫患者与健康人群筛选出来，但这种筛查手段的特异性低，导致相应的假阳性率增高。特异性最高的筛查手段为血细胞分析联合毛细管电泳均异常判为筛查异常，其试验的特异性为65.0%，可以有效地排除非地贫人群，同时其试验灵敏度为72.7%，试验准确度为67.8%（为四种筛查手段中最高），灵敏度、特异性、准确度均较高，所以以血细胞分析联合毛细管电泳均异常作为筛查标准时，其在地贫筛查中的诊断效能最好，可以有效地降低漏诊率，提高阳性检出率。但当临床需要为排除健康人群时，则采用灵敏度最高的诊断标准，可以有效地降低假阴性率。

血红蛋白电泳和血细胞分析作为地中海贫血的筛查手段，两种检测均可以在一般的医院中开展，所以，以血红蛋白电泳联合血细胞分析检测作为地中海贫血的筛查手段，可以有效地检出大部分的地中海贫血患者。但是随着灵敏度升高、相应的特异性会降低，出现更多的非特异性反应而出现诊断阳性率降低。所以从患者本身情况出发，当需要减少漏诊率时，应选择实验灵敏度更高的诊断方法，选择电泳检测与血细胞参数检测，当出现异常时即进行基因检测，可以减少漏诊率。当患者存在经济原因时，则先进行血细胞分析，当出现异常时再进行电泳检测，结合检测结果再决定是否进行基因检测。