肿节风高效薄层色谱鉴别

韦卓纯, 黄卫娟, 姚志红, 顾利红, 栗建明

(1.东莞市第五人民医院,广东 东莞523900；2.暨南大学中药及天然药物研究所,广东 广州510632；3.广州市药品检验所中药室,广东 广州510160)

肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.) Nakai 的干燥全草［1］,具有显著的抗菌［2］、消炎［3］、抗肿瘤［4］作用,临床疗效确切,已知活性成分有异嗪皮啶［5-6］等香豆素类和迷迭香酸［7-8］等有机酸类,此外还有黄酮、倍半萜和挥发油等［9-11］。2015 年版《中国药典》及相关报道［12-14］中有关肿节风的薄层鉴别大多仅检测了指标成分异嗪皮啶,一般均采用传统TLC 法,在实际操作过程中发现部分斑点间重叠,不能得到很好的分离,未能充分反映该药材信息,从而影响了方法灵敏度,而且《中国药典》 采用甲苯展开系统,毒性较大。因此,本研究在2015 年版《中国药典》 基础上,通过展开条件的优化寻找极性合适、毒性较小的溶剂替代甲苯,探索专属性强、灵敏度高的肿节风高效薄层色谱(HPTLC)［15］鉴别方法。

1 材料

BP211D 电子天平(十万分之一,德国赛多利斯公司)；KQ3200E 超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；定量毛细管(美国Dummond 公司)；硅胶G60 高效薄层板(德国Merck 公司)；硅胶G60 薄层板(德国MN公司)；硅胶G60 薄层板(山东烟台维启化工产品有限公司)。异嗪皮啶［萨恩化学技术(上海) 有限公司,批号BI180108,含有量97.86%］；迷迭香酸(美国Sigma 公司,批号MKBQ 2631V,含有量98.74%)；肿节风对照药材(广州市药品检验所,批号121048-201205)。所用试剂均为分析纯。

13 批药材(S1 产自河北,S2 ～S3 产自浙江,S4 产自重庆,S5 产自四川,S6～S9 产自江西,S10 产自福建,S11产自广东,S12～S13 产自广西) 均由广州市药检所中药室顾利红主任药师鉴定为正品。

2 薄层色谱鉴别

2.1 供试品溶液制备 取药材粉末2 g,加50 mL 水超声处理30 min,滤过,滤液加乙酸乙酯振摇提取2 次,每次25 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加1 mL 甲醇溶解,即得。

2.2 对照品、对照药材溶液制备 取异嗪皮啶、迷迭香酸对照品适量,加甲醇制成每1 mL 分别含0.5 mg 2 种成分的相应溶液。另取对照药材粉末2 g,按“2.1” 项下方法制备相应溶液。

2.3 展开系统选择 以异嗪皮啶、迷迭香酸对照品溶液和对照药材作为参照,将药材供试品溶液(S7) 点于同一块硅胶G60 高效薄层板上,选择了3 种展开溶剂,置紫外灯(365 nm) 下检视,结果见图1。当采用2015 年版《中国药典》 展开剂,即甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9 ∶4 ∶1) 时,薄层图谱上半部分成分未能很好展开；展开剂为环己烷-乙酸乙酯-甲酸(7 ∶6 ∶1) 时,薄层色谱图中上半部分成分的分离有所改善；当展开剂为环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4 ∶5 ∶1) 时,薄层色谱图中大部分成分均能得到很好分离,比移值适中,而且环己烷毒性比甲苯小,故采用环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4 ∶5 ∶1) 作为展开剂。

2.4 薄层鉴别法建立 参照薄层色谱法(2015 年版《中国药典》 一部附录ⅥB) 试验,吸取供试品、对照品、对照药材溶液各2 μL,分别点于同一硅胶G60 高效薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(4 ∶5 ∶1) 为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm) 下检视。结果,供试品色谱在与对照药材、对照品相应位置上显示相同颜色的荧光斑点,见图2。

图1 药材与对照品薄层色谱图（相对湿度30%，温度20 ℃）

图2 13 批样品和对照药材薄层色谱图（相对湿度25%，温度21 ℃）

2.5 系统适应性考察

2.5.1 专属性考察 取药材供试品溶液(S7)、异嗪皮啶对照品溶液 (0.5 mg/mL)、 迷迭香酸对照品溶液(0.5 mg/mL)、对照药材溶液各2 μL,在“2.4” 项条件下展开,结果见图3,表明供试品色谱在与对照药材、对照品相应位置上显示相同颜色的荧光斑点。置氨蒸汽中熏10 min时,与对照品色谱相应的斑点变为黄绿色,即异嗪皮啶,表明方法专属性良好。

图3 药材专属性考察薄层色谱图（相对湿度30%，温度20 ℃）

2.5.2 稳定性试验 对室温下静置不同时间(0、1、3、5 d) 样品溶液的薄层色谱行为进行比较,在“2.4” 项条件下展开,干燥,置紫外灯(365 nm) 下检视。色谱图见图4,表明溶液在5 d 内稳定性良好。

2.5.3 薄层板影响 固定温度和相对湿度,比较不同厂家薄层板展开的薄层效果,在“2.4” 项条件下展开,干燥,置紫外灯(365 nm) 下检视。结果,3 种薄层板均能检测到异嗪皮啶和迷迭香酸,而分离度和薄层色谱图提供的信息丰富程度则显示高效薄层板(Merck 公司) 展开效果最好,见图5。

图4 稳定性考察薄层色谱图（相对湿度42%，温度21 ℃）

3 讨论

3.1 前处理方法考察 考察了用石油醚、甲醇、水超声提取后肿节风的薄层色谱图,结果表明用有机溶剂提取后色谱图上部分可看到许多红色荧光斑点,提示色素类成分较多；采用水提取处理时背景较为干净,杂质斑点干扰较少,故选择该方法。

3.2 点样量选择 前期比较了点样量1、2、4、8、10 μL,发现1 μL 时部分斑点不清晰,而超过2 μL 时色谱峰出现超载现象,分离度较差,故选择点样2 μL。

3.3 温度、相对湿度影响 比较不同温度(4、25 ℃) 下的薄层色谱图,结果表明温度对薄层色谱无显著性影响。然后,比较不同相对湿度(20%、72%) 下的薄层色谱图,结果表明随着相对湿度的增大,色谱图上半部分分离度有所下降,提示实际操作过程中应注意控制相对湿度。

图5 不同厂家薄层板薄层色谱图（相对湿度42%，温度19 ℃）

3.4 异嗪皮啶主斑点确定 采用高效薄层板的色谱图中,异嗪皮啶对照品在365 nm 下可检测到2 个斑点,而在普通TLC 板中只看到1 个,一方面提示该对照品可能存在杂质或者同分异构体,另一方面则提示HPTLC 法分离度更高。另外,肉眼观察比移值较低的斑点面积较大,为进一步确证,将薄层板置氨蒸汽中熏10 min,再在365 nm 下检视,发现对照品色谱相应的斑点变为黄绿色,即异嗪皮啶,从而确证比移值较低的斑点为异嗪皮啶。

3.5 HPTLC 法优势 HPTLC 法采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素作为固定相,其分离度和灵敏度明显优于普通TLC 法［15］。该方法主斑点清晰,易于检出,专属性强,灵敏度高,稳定性好,同时检测了指标成分异嗪皮啶和抗炎活性成分迷迭香酸,能更全面地反映肿节风质量。