厚皮香酚性成分及其镇痛活性

李骅轩, 崔淑君, 肖朝江, 董 相, 沈 怡, 姜 北

(大理大学药物研究所药学与化学学院,云南 大理671000)

山茶科厚皮香属植物主要分布于中美洲、南美洲、西南太平洋各岛屿、非洲及亚洲等泛热带和亚热带地区,我国有14 个种,广泛分布于长江以南各省区,多数种产于广东、广西及云南等省区［1］。厚皮香Ternstroemia gymnanthera(Wight et Arn.)Beddome 为多年生常绿乔木或灌木,始载于《植物名实图考》,云“生云南山中,小树滑叶,如山栀子,开五瓣白花……”,广泛分布于长江以南各省区；据《中华本草》 记载,厚皮香的叶或全株可入药,性苦、凉,具有清热解毒、散瘀消肿之功效［2］。有关厚皮香的研究早在上个世纪就已开始,分离鉴定了原花青定苷以及萜类、酚酸类、苯乙醇类等化合物［3-5］；在前期开展的云南药用植物镇痛活性筛选研究工作中发现,厚皮香提取物具有较好的镇痛活性。为了全面了解厚皮香中的相关活性成分,本实验从该植物95%乙醇提取物乙酸乙酯部位中分离得到8 个酚类化合物,其中化合物1 ～3、5～8 均为首次从该植物中分离得到,1、3、5、7 ～8 为首次从该属植物中分离得到,1、4、7 具有显著的镇痛活性。

1 材料

1.1 仪器与试剂 Bruker Avance Ⅲ-400 型核磁共振仪(德国Bruker 公司)；Agilent 1260 型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)；LC-20 制备型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；小鼠独立通气笼(苏杭科技器材有限公司)；柱层析硅胶和GF254(青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences 公司)；反相硅胶RP18(日本Fuji公司)。冰醋酸(上海国药集团化学试剂责任有限公司)；无菌生理盐水(天津市风船化学试剂科技有限公司)；阿司匹林(沈阳奥吉娜药业有限公司)；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等均为工业级,重蒸后使用。SPF 级昆明种(KM) 小鼠,雌雄各半,许可证号SCXK(湘) 2016-002,体质量18～22 g。

1.2 药材 样品于2017 年7 月采自云南省漾濞县秀岭,由大理大学姜北教授鉴定为厚皮香Ternstroemia gymnanthera(Wight et Arn.)Beddome,标本(20151008-6) 存放于大理大学药物研究所姜北教授研究组。

2 提取与分离

厚皮香干燥地上部分(14 kg) 用95%乙醇冷浸提取8 次, 提取液合并浓缩, 得到提取物2.3 kg。将其分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位。

乙酸乙酯部位加入适量粗硅胶(80 ～100 目)拌样, 经300 ～400 目硅胶柱层析, 氯仿-甲醇(1 ∶0～0 ∶1) 溶剂系统梯度洗脱,划分成7 个部分(A～G)。

B 组分经MCI 柱脱色素、 反复硅胶柱色谱(石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、 Sephadex LH-20、 制备型高效液相纯化,经重结晶处理后得化合物1 (600 mg)、2(1.0 g)、3(1.8 g)、4(148 mg)、7(7 mg)。

D 组分经反复硅胶柱色谱(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、Sephadex LH-20、制备型高效液相纯化后得化合物5(5 mg)、6(5 mg)、8(6.5 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：黄色结晶 (丙酮)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：8.82(1H,s,7-OH),7.85(1H,d,J ＝9.5 Hz,H-4),7.20(1H,s,H-5),6.80(1H,s,H-8),6.18(1H,d,J ＝9.5 Hz,H-3),3.90(3H,s,-OCH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3COCD3)δ：161.2(C-2),113.2(C-3),144.6(C-4),112.0(C-4a),109.8(C-5),145.9(C-6),151.7(C-7),103.6(C-8),151.0(C-8a),55.6(-OCH3)。以上数据与文献［6］ 基本一致,故鉴定为东莨菪内酯。

化合物2：黄色油状物。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：7.52(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),7.43(1H,dd,J ＝8.4,2.1 Hz,H-6),7.00(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5),3.91(3H,s,-OCH3)；13CNMR(100 MHz,CD3COCD3)δ：186.0(-COOH),165.8(-C ＝O),125.6(C-1),116.3(C-2),146.1(C-3),153.1(C-4),116.2(C-5),125.4(C-6),52.8(-OCH3)。以上数据与文献［7］ 基本一致,故鉴定为4-hydroxy-3-(methoxycarbonyl) benzoic acid。

化合物3：无色针晶 (甲醇)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：9.76(1H,s,-CHO),7.43(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2),7.36(1H,dd,J ＝8.1,2.0 Hz,H-6),7.03(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5)；13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3) δ： 192.0 (-CHO),130.5(C-1),115.1(C-2),146.3(C-3),152.5(C-4),116.0(C-5),125.8(C-6)。以上数据与文献［8］ 基本一致,故鉴定为原儿茶醛。

化 合 物4： 黄 色 固 体。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：6.79(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2′),6.72(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5′),6.68(1H,dd,J ＝8.1,2.0 Hz,H-6′),4.64(1H,s,H-2),3.64(3H,s,1-OCH3),3.27(3H,s,2-OCH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：173.4(C-1),83.1(C-2),128.8(C-1′),115.4(C-2′),147.0(C-3′),146.5(C-4′), 116.2 (C-5′), 120.4 (C-6′), 52.6 (1-OCH3),57.0(2-OCH3)。以上数据与文献 ［4］基本一致,故鉴定为methyl 2-methoxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl) acetate。

化合物5：褐色油状物。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.67(1H,d,J ＝8.0 Hz,H-5),6.65(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),6.52(1H,dd,J ＝8.0,2.1 Hz,H-6),3.66(2H,t,J ＝7.2 Hz,H-2′),2.66(2H,t,J ＝7.2 Hz,H-1′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD) δ：131.7 (C-1),116.3 (C-2),146.1(C-3),144.6(C-4),117.0(C-5),121.2(C-6),39.7(C-1′),64.6(C-2′)。以上数据与文献［9］ 基本一致,故鉴定为3,4-二羟基苯乙醇。

化合物6：褐色油状物。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.70(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),6.69(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5),6.56(1H,dd,J ＝8.1,2.1 Hz,H-6),3.65(3H,s,-OCH3),3.46(2H,s,H-1′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：126.9(C-1),116.3(C-2),146.2(C-3),145.4(C-4),117.3(C-5),121.6(C-6),41.1(C-1′),174.6(C-2′),52.4(-OCH3)。以上数据与文献 ［10］基本一致,故鉴定为3,4-二羟基苯乙酸甲酯。

化合物7： 白色羽状结晶 (甲醇)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：9.85(1H,s,-CHO),7.80(2H,d,J ＝8.7 Hz,H-2,6),7.00(2H,d,J ＝ 8.7 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz,CD3COCD3) δ： 191.0 (-CHO), 130.4 (C-1),132.8(C-2,6),116.7(C-3,5),163.9(C-4)。以上数据与文献［11］ 基本一致,故鉴定为对羟基苯甲醛。

化 合 物8： 白 色 固 体。1H-NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ：6.81(1H,d,J ＝2.2 Hz,H-2),6.75(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5),6.62(1H,dd,J ＝8.1, 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ：127.2(C-1),115.8(C-2),145.6(C-3),144.7(C-4),117.2(C-5),121.5(C-6),40.7,(C-1′),173.4(C-2′)。 以 上 数 据 与 文 献［12］ 基本一致,故鉴定为3,4-二羟基苯乙酸。

4 镇痛活性［13-15］

采用小鼠醋酸扭体实验模型对供试品的镇痛活性进行测定。小鼠实验前12 h 禁食不禁水,随机分为模型组、实验组、对照组,每组6 只,各供试品剂量为粗提物1 000 mg/kg、单体化合物50 mg/kg,灌胃给药(0.1 mL/10 g),模型组给予等量溶剂,阳性对照组给予阿司匹林 (200 mg/kg)。 给药40 min后,每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液(0.1 mL/10 g),观察并记录注射后15 min 内扭体潜伏期及扭体次数,按下列公式计算受试物对小鼠醋酸扭体的抑制率,以此评价镇痛作用。结果见表1。

抑制率＝ ［ (模型组扭体均数-给药组扭体均数)/模型组扭体均数］ ×100%。

由表可知,厚皮香粗提物在1 000 mg/kg 剂量时显示出一定的镇痛活性,其乙酸乙酯部位在同等剂量下镇痛活性有所提高,即为有效活性部位。化合物剂量在50 mg/kg 时,小鼠的扭体次数较模型组明显减少, 其中1、 4、 7 有显著差异 (P ＜0.05),抑制率大于阳性药阿司匹林,呈现出显著的镇痛活性。结合化合物2 ～3 所表现出的抑制小鼠醋酸扭体作用,可知所有化合物均为厚皮香镇痛活性成分。

表1 镇痛活性实验抑制率n=6）Tab.1 Inhibition rates in analgesic activities testsn=6）

表1 镇痛活性实验抑制率n=6）Tab.1 Inhibition rates in analgesic activities testsn=6）

注：与模型组比较,ΔΔP＜0.01

组别 剂量/(mg·kg-1) 扭体次数/次 抑制率/%模型组 — 37.33±3.39 —阿司匹林组 200 20.50±2.52ΔΔ 45.08粗提物组 1 000 27.00±4.34 27.67乙酸乙酯部位组 1 000 25.80±2.39 30.89化合物1 组 50 17.60±4.77ΔΔ 52.86化合物2 组 50 24.75±8.34 33.70化合物3 组 50 31.60±4.10 15.35化合物4 组 50 16.40±4.51ΔΔ 56.07化合物7 组 50 19.83±5.56ΔΔ 46.88

5 讨论

本研究采用小鼠醋酸扭体模型,初步考察了厚皮香粗提物、乙酸乙酯部位及化合物1 ～4、7 的镇痛活性,结果发现所有供试品均具有一定作用,部分甚至优于阳性药阿司匹林,表明厚皮香镇痛作用有相应的物质基础。另一方面,本研究中分离得到的多种酚性成分在其他相关研究中也已被证实具有显著的镇痛消炎作用,如东莨菪内酯(1) 是雪莲、紫花前胡、月桂等药用植物抗炎和镇痛的主要活性物质［16］；原儿茶醛(3) 是活血定痛合剂、活血止痛汤中主要活性成分［17-18］；3,4-二羟基苯乙醇(5) 为炎立消片和炎立消胶囊中的主要活性成分［19］；对羟基苯甲醛(7) 为天麻重要的镇痛镇静成分［20］。文献报道,0.6%苯酚和0.45%布比卡因混合液用于胆囊切除术后镇痛时,可有效减少吗啡的用量, 显著增加镇痛效果［21］； Candido等［22］通过研究也发现苯酚用于治疗顽固性疼痛有很好的效果,并且可以缓解阿片类受体药物引起的副作用。此外,从镇痛抗炎成分乙酰水杨酸［23］结构上看,本研究分离得到的许多成分与其具有一定的相似性,因此具有与阿司匹林相似或更好的镇痛抗炎活性亦十分合理,由此更进一步明晰了厚皮香镇痛活性与酚性成分之间可能存在的内在联系。

近年来有关小分子酚性成分生物活性方面的研究不断涌现,揭示了酚酸类化合物具有除镇痛抗炎以外更多的生物活性,包括抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗病毒作用等［24-25］,如3,4-二羟基苯乙酸甲酯(6) 可抑制EV71 病毒在RD 细胞中的复制,具有抗病毒潜力［26］,因此,关于小分子酚性成分分离鉴定与活性研究十分重要。本研究丰富了厚皮香属植物中化学成分的多样性,为后续研究该属植物化学成分、活性物质、潜在药用价值等奠定了基础,也为开发利用相关资源提供了参考。