猪德尔塔冠状病毒纳米PCR检测方法的建立

董志珍，张 霞，柴铭骏，陈小金，贾 赟，肇慧君，帅江冰

（1. 天津海关动植物与食品检测中心，天津 300451；2. 大连海关技术中心，辽宁大连 116001；3. 杭州海关技术中心，浙江杭州 310007）

病毒性腹泻是影响猪群生产的一种常见的多发性疾病，而引起腹泻的病原多而复杂[1-2]。张志等[3]对我国5 省（自治区）的部分规模猪场开展研究，发现猪场的腹泻流行率达71.99%。2014 年，美国23 个州共暴发了2 692 起腹泻疫情，其他国家如德国、法国、瑞士、意大利、韩国、泰国和越南等国也在近年来相继暴发腹泻疫情。疫情流行范围广，传播迅速，造成了严重经济损失[4-6]。其中，美国俄亥俄州猪场发生的疫情，临床症状与猪流行性腹泻相似，呈现水样腹泻并且死亡率达30%~40%。Wang 等[4]对该疫情进行检测，发现有类冠状病毒样颗粒，最终确定病原为猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。随后该疫情迅速传播到美国其他州和加拿大，对养猪业造成明显的经济损失[5]。Marthaler等[7]对美国部分地区猪场样品进行检测，发现PDCoV 阳性率为30%，表明PDCoV 在美国中东部普遍存在。

随着科技发展，纳米技术渗透到各个领域，尤其是分子生物学领域，而纳米技术与PCR 技术的交叉渗透更是值得关注。研究人员发现，将引物连接在纳米粒子表面后，显著提高了PCR 的特异性，改善了非特异性扩增，并提高了扩增效率[8-11]。

目前，针对PDCoV 的研究相对较少。虽有研究人员已建立了RT-PCR、探针法荧光PCR、ELISA 等检测方法，但未见PDCoV 纳米PCR 检测方法的相关报道。纳米PCR 具有操作简便、成本低等优点，可广泛应用于基层实验室。本研究建立的纳米PCR 检测方法，旨在丰富PDCoV 检测技术体系，为进出境活猪病毒性腹泻疫病检测及防控、预警提供有力的技术手段，为防止外来重要动物疫病传入提供保障。

1 材料与方法

1.1 病毒

试验中使用的病毒株包括：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）。腹泻三联活苗分别为弱毒CV777 株、弱毒华毒株和NX 株，由哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.2 临床样品

2017 年收集的国内部分省市（天津市、北京市、上海市、山西省、辽宁省、黑龙江省和浙江省等）猪场腹泻粪便62 份，2017 年本实验室收集的由天津海关进境的种猪粪拭子（源自加拿大和美国）268 份。

1.3 主要试剂和仪器

M-MLV 反转录酶、随机引物，购于Promega公司；Nano-taq 试剂盒，购自山东大正生物有限公司；pUC19、DNA Marker、Premix ExTaq、Easy dillution，购自大连宝生物工程有限公司；RNA提取试剂盒，购自上海捷瑞生物技术有限公司；Axygen DNA Gel Extraction Kit，购自Axygen 公司。

旋涡震荡器QL-861，购自江苏省海门市麒麟医用仪器厂；洁净工作台SW-CJ-2D，购自苏州净化设备有限公司；台式高速冷冻离心机Neofuge13R，购自上海力申科学仪器有限公司；普通PCR 仪，购自Bio-Rad 有限公司；金属恒温连接仪，购自Eppendorf 公司。

1.4 引物设计与合成

根 据GenBank 中 登 录 的PDCoV 毒 株（KP757891）基因序列，利用Primer premier 6.0软件设计特异性引物，用于扩增PDCoV M 基因全长片段，预期扩增目的片段长度为654 bp。将PDCoV M 基因的完整编码序列克隆到质粒载体pUC-19 中作为标准对照，得到pUC-19-PDCoV-M 重组子；用试剂盒纯化重组质粒pUC-19-PDCoV-M，并用紫外分光光度计测定浓度；通过PCR和测序确认重组子，并置于-20 ℃保存备用。设计另外一组引物，扩增PDCoV M 基因的部分保守序列用于纳米PCR，预测扩增长度为536 bp。引物由上海捷瑞合成生物技术有限公司合成，特异性引物序列见表1。

1.5 病毒核酸提取和反转录

取500 mg 阳性粪便样品加入500 μL 灭菌生理盐水，5 000 r/min 4 ℃离心30 min，弃沉淀保留上清；粪拭子采集完成后立即置于预先加有1 mL生理盐水的15 mL 离心管中，振荡洗涤并挤干，弃去拭子，5 000 r/min 4 ℃离心30 min，弃沉淀保留上清。取100 μL 上清，按试剂盒操作说明提取RNA，收集RNA 置于-70 ℃保存。

表1 引物序列

以上述方法提取的RNA 为模板进行反转录，合成cDNA，于-20 ℃保存备用。反应体系30 μL：随机引物1.0 μL、5×RT Buffer 6.0 μL、dNTP 1.0 μL、Rnase Inhibitor 1.0 μL、M-MLV 反转 录 酶1.0 μL、RNA 12.0 μL，用ddH2O 补 至30 μL。反应程序为：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。

1.6 纳米PCR 和常规PCR

使用引物组（M2F 和M2R）分别进行PDCoV 纳米PCR 和常规PCR 分析，扩增预测长度为536 bp 的PCR 产物。

纳米PCR 反应体系（12.0 μL）：2×纳米缓冲 液6.0 μL，M2F 和M2R（10 μmol/ L）各0.5 μL，模板或标准质粒0.5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，加ddH2O 至12.0 μL。反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s 和72 ℃ 15 s（30个循环）；72 ℃ 10 min。

常 规PCR 反 应 体 系（25.0 μL）：ExTaq Premix 12.5 μL，M2F 和M2R（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增条件为：94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s 和72 ℃30 s（30个循环）；72 ℃ 5 min。

1.7 纳米PCR 反应条件优化

用M2F 和M2R 引物对、反转录的cDNA 模板进行PDCoV 纳米PCR 反应，并优化退火温度、模板和引物体积等因素。Bio-Rad 热循环仪的退火温度范围为52~60 ℃，模板体积范围为0.5~2.0 μL，引物体积范围为0.5~2.0 μL。扩增产物经电泳后在凝胶成像仪上进行分析。

1.8 纳米PCR 敏感性

使 用Takara 的easy dillution，对pUC-19-PDCoV-M 质粒进行10 倍梯度稀释（范围为108~102copies/μL），将PDCoV 纳 米PCR 测 定检测的检测下限与常规PCR 进行比较，并使用ddH2O 作阴性对照，将PCR 产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。

1.9 纳米PCR 特异性

对TGEV、PEDV 和PRoV 等 猪 腹 泻 病 毒cDNA 进行纳米PCR 检测，以确定本试验建立的方法是否对其他几种常见腹泻病毒有交叉反应；将PCR 产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。

1.1 0 临床样本检测

将2017 年收集的62 份粪便样品及268 份进境种猪粪拭子，按照1.5 所述方法提取RNA 并反转录成cDNA，以最佳反应体系和反应条件进行纳米PCR 检测，同时以上述样品的cDNA 作为模板进行常规PCR 检测，对比这2 种方法的检测结果。

2 结果

2.1 纳米PCR 反应条件优化

本研究比较了3 个长度分别为536、300 和426 bp 的引物对。选择引物对（M2F 和M2R）用于常规PCR 和纳米PCR 测定（数据未显示），扩增结果见图1-A。纳米PCR 检测方法的优化包括调整退火温度、引物和模板体积。结果显示，退火温度为52 ℃时，扩增效果最好（图1-B）。使用该退火温度，发现条带密度为0.5 μL（10 μmol/L）的引物体积（图1-C）和0.5 μL 的模板体积（图1-D）时最大，扩增效率最高。

基于PDCoV 纳米PCR 测定的不同退火温度、引物和模板体积获得的结果，建立了最佳反应体系：2×纳米缓冲液6.0 μL，上游和下游引物（10 μmol/ L）各0.5 μL，模板或标准质粒0.5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL，加ddH2O 至 12 μL。反应条件如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s 和72 ℃ 15 s（30 个循环）；72 ℃ 10 min。

2.2 纳米PCR 敏感性

敏感性试验显示，PDCoV 纳米PCR 最低检测限为102copies/μL，比常规PCR（103copies/μL）略高（图2）。

2.3 纳米PCR 特异性

琼脂糖凝胶电泳分析显示，PDCoV 纳米PCR测定与其他几种相关病毒没有交叉反应（图3）。

2.4 临床样品检测

对临床样品同时进行PDCoV 纳米PCR 和常规PCR 检测，粪便样品的阳性检出数分别是20 份和16 份（表2），进境种猪粪拭子样品均呈阴性。与常规PCR 相比，纳米PCR 的相对灵敏度更高。

3 讨论

能够引起猪腹泻的病原有很多，包括细菌、病毒和寄生虫等，其中由病毒引起的腹泻对仔猪影响最大。PDCoV 作为仔猪病毒性腹泻新病原，为全球仔猪病毒性腹泻防控工作带来了新挑战。因此，世界各国的研究人员针对PDCoV 开展了一系列研究，包括病毒基因序列分析、蛋白功能研究、病毒分离培养以及动物实验、检测方法等。本研究通过分析GenBank 上登录的PDCoV 国内外毒株基因序列，选择编码结构蛋白的M 基因作为靶基因设计特异性引物，建立了PDCoV 纳米PCR 检测方法。试验结果显示，该方法具有较好的特异性，敏感性。但本方法对268 份进境种猪粪拭子检测结果均为阴性。这与Marthaler 等[7]的研究结果（阳性率30%）存在一定的差异。产生这种情况的原因有两个：一方面由于美国发生疫情后，原质检总局要求针对源自美国的生猪增加PDCoV 检测项目，美国方面也在预检时进行PEDV 和PDCoV 检测，故本实验收集的进境种猪粪拭子检测结果为阴性；另一方面就目前文献资料报道，3 种肠道冠状病毒致病致死的主要对象是仔猪，而成年猪（种猪、母猪）对这些病毒呈现一过性感染，本实验室收集的样品均为种公猪，故检测均为阴性，这符合实际情况。

图1 纳米 PCR 扩增条件优化结果

图2 敏感性试验结果

M. 100 bp DNA Ladder；1. PDCoV；2. TGEV；3. PED；4. PRoV；5. 阴性对照

表2 粪便样品PDCoV 检测结果 单位：份

图3 纳米PCR 特异性试验结果

纳米PCR 技术是将纳米颗粒的特殊性能应用于PCR 反应中的新技术，通过在反应体系中添加纳米颗粒，可显著提高PCR 反应的扩增效率，同时提升方法的特异性和敏感性。本研究将纳米PCR技术应用于PDCoV 检测，可实现快速、灵敏、特异的检测目的，并且操作简单。同时所建立的纳米PCR 检测方法反应体系仅为12 μL，因而大幅度节约了成本，适合大批量样本检测。该检测方法的建立为防止外来重要动物疫病传入提供了有力的技术手段和保障，有助于进一步完善生猪检验检疫体系。