羊口疮病毒B2L 基因密码子偏好性分析

张 静，陈翠英，李静静，张七斤

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.赤峰市巴林左旗石棚沟林场，内蒙古赤峰 025450；3.庆城县动物疫病预防控制中心，甘肃庆城 745100）

羊口疮病毒（ORFV）B2L 基因长1 137 bp，编码蛋白分子量大小41.67 ku。B2L 蛋白是ORFV的主要囊膜蛋白，是ORFV 粒子囊膜的重要组成部分，是主要的免疫优势抗原，可刺激机体产生免疫反应。目前研究发现，该蛋白具有脂肪酶活性，猜测可以增强病毒毒力，减弱宿主免疫应答水平[1]。B2L 蛋白与牛痘病毒的外壳抗原蛋白p37K 高度相似，主要负责胞外病毒的形成，具有较强的免疫原性[2]。B2L蛋白是一种棕榈酰化蛋白，作为病毒粒子囊膜表面的主要抗原，可以刺激机体产生强烈的抗体反应，使淋巴细胞活化，这对于病毒的包装和运出来说是必不可少的[3]。尽管ORFV 免疫应答方式以细胞免疫为主，但B2L 蛋白能够诱导机体产生强烈的抗体反应，同时刺激淋巴细胞大量增殖，且B2L 基因在副痘病毒属中具有高度保守性[4]。

分析密码子偏好性使用情况，用靶基因最优密码子设计最合适的外源表达载体，可以提高靶基因的表达量。通过优化目的基因mRNA 中的稀有密码子，可以避免目的基因在外源表达系统中出现表达量的降低或者翻译速率的降低[5]。因此，本研究对克隆的B2L 基因序列，以Visual Gene Developer 软件，分析该基因在密码子使用上存在的偏好性，从而选择一个最适的表达系统进行表达，以增加B2L 蛋白在表达系统中的表达量。基因密码子的使用情况与基因所编码的蛋白功能和二级结构有关，分析B2L 基因密码子的使用偏好性也可以对B2L 蛋白的结构和功能研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 病毒株

分离株ORFV/QD/2015，内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室分离保存[6]。

1.2 主要试剂

病毒DNA 提取试剂盒、DL 2 000 bp DNA Marker、2×Easy Taq SuperMix、质粒DNA 提取试剂盒等，购自TIANGEN 公司。

1.3 主要仪器

G-BOXHR 紫外凝胶成像系统、梯度PCR 仪、BGP600i 琼脂糖凝胶电泳仪。

1.4 引物设计与合成

根据GenBank 上发表的毒株OV-SA00 全基因参考序列，用Primer 5.0 生物软件设计B2L 基因特异性引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 特异引物序列

1.5 基因测序及生物信息学分析

将电泳检测的条带样品，送上海生工生物工程股份有限公司测序，用DNAstar 软件，将测序结果拼接。对克隆的B2L 基因序列，用Visual Gene Developer 软件中的Codon Usage Calculation 功能，分析该基因密码子的使用偏性，包括相对同义密码子使用度（RSCU）、密码子适应指数（CAI）、有效密码子数（ENC）、密码子第3位GC含量（3GCs）。

此外，本研究所用的毕赤酵母菌（Pichia pastoris）、大肠杆菌（Escherichia coli）、昆虫杆状病毒（insect baculovirus）模型生物基因组的密码子使用频率均来源于数据库（https://www.kazusa.or.jp/codon）。

2 结果

2.1 B2L 基因PCR 扩增

ORFV/QD/2015 株B2L 基因PCR 扩增结果如图1 所示，目的片段为1 137 bp。PCR 扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

图1 ORFV/QD/2015 株B2L 基因PCR 扩增产物电泳图

2.2 B2L 基因在不同表达系统中密码子使用偏性比较

利用Visual Gene Developer 软件，分析B2L基因密码子的使用偏性，计算B2L 基因在不同表达系统中的相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）。结果（表2）显示，B2L 基因在大肠杆菌中有25 种密码子RSCU ＞1，在毕赤酵母中有33 种密码子RSCU ＞1，在昆虫杆状病毒中有27 种密码子RSCU ＞1；B2L 基因的密码子偏好性参数分析显示，B2L 基因在毕赤酵母、大肠杆菌、昆虫杆状病毒中的有效密码子数（effective number of codon，ENC）均为20.836，密码子适应指数（codon adaptation index，CAI）分 别 为0.4836、0.6468、0.7123，3GCs 值 都 为94.723（表3）。B2L 基因密码子在大肠杆菌表达系统中使用频率第一的是CTG，在毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统中使用频率第一的均是TTG（表4）。

表2 B2L 基因在不同表达系统中的密码子使用偏性比较

4 分析与讨论

RSCU 是密码子在编码氨基酸的同义密码子间的相对概率，如果RSCU 等于1，则密码子的使用没有偏好性；若RSCU 大于1，则该密码子是使用较多的密码子。有效密码子数（effective number of codon，ENC）在20~61 之间，越靠近20 偏性越强。通过分析B2L 基因的密码子偏好性参数，发现B2L 基因ENC 为20.836。ENC 偏小，表明各密码子在编码氨基酸时出现的频率不一致，因此B2L基因中的各密码子具有明显的偏好性。

表3 B2L 基因在不同表达系统中的密码子偏好性参数

表4 B2L 基因在不同表达系统中密码子使用频率前三的密码子

CAI 是根据已知高表达基因的序列，来估计未知基因密码子使用的偏好性程度[7]。CAI 在0~1之间，越接近1 则表明密码子使用偏好性越强[8]。B2L 基因在毕赤酵母、大肠杆菌、昆虫杆状病毒中的CAI 指数分别为0.4836、0.6468、0.7123，说明B2L 基因在昆虫杆状病毒表达系统中密码子使用偏好性较强。

3GCs 代表第3 位上的GC 含量。研究发现，偏好C/G 结尾的密码子有利于提高翻译的准确度，表明B2L 基因编码区在碱基选择及其密码子结尾碱基选择上存在C/G 的偏好性[9-10]。3GCs 都为94.723，表明B2L 基因在3 种表达系统中都偏好C/G 结尾的密码子。

5 结论

本研究运用Visual Gene Developer 生物信息学软件，分析ORFV B2L 基因在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中的密码子使用偏好性。综合各表达系统的密码子偏好性分析结果，发现B2L基因在昆虫杆状病毒表达系统中会得到更好的表达，这为B2L 基因表达系统的选择提供了参考。