江苏地区金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究

洪 捷，曹 阳2，谈忠鸣，钱慧敏，董 晨，顾 玲，孔筱筱，周 璐

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是导致社区感染和院内感染的一种重要病原菌。SA广泛分布于健康人的皮肤表面和鼻咽等部位，并可感染人引起多种侵袭性疾病和毒素性疾病[1]。抗生素是治疗细菌感染的主要药物，但随着抗生素广泛使用，SA对各类抗生素的敏感性逐渐降低。在我国，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)检出率较高，最高占SA感染总数的50%以上[2]。多数MRSA对目前临床应用的绝大多数抗生素均耐药，且其感染长发生于免疫缺陷、大面积烧伤、大手术后及老年患者，容易造成流行和暴发，病死率可高达50%。

SA对不同的抗生素有不同的耐药机制，对β-内酰胺类药物的耐药,主要通过mec基因复合体调控合成新的青霉素结合蛋白以及合成β-内酰胺酶阻止药物到达作用靶点两种方式[3]； 对于四环素类药物耐药，主要通过tetM基因加速药物自核糖体解离以及tetK基因编码外排泵蛋白加速药物外排的方式来实现[4]；对大环内酯类药物的耐药,主要通过erm基因修饰靶位核糖体而阻止药物与之结合、产生灭活酶灭活大环内酯类抗生素以及esr基因调控加速药物泵出的方式[5]。

本文通过研究2017年全省范围内收集的227株金黄色葡萄球菌，检测其对15种抗生素的耐药性，检测7种耐药基因的携带率，同时采用MLST方法对金葡菌进行分子分型，分析不同地区、不同来源的金葡菌的耐药性、耐药机制和分子流行病之间的特征关系。

1 材料与方法

1.1对象 本研究中的227株金黄色葡萄球菌均为2017年通过国家致病菌识别网收集，菌株来自全省13个设区市的26家哨点医院，其中苏中地区40株，苏北地区87株，苏南地区100株，药敏质控株粪肠球菌ATCC29212和金黄色葡萄球菌ATCC29213均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 方 法

1.2.1药物敏感性检测 采用微量肉汤稀释法检测金葡菌对抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。检测使用的药敏板为商品化的致病菌识别网定制板条，检测的抗生素包括苯唑西林、头孢西丁、青霉素、四环素、红霉素、克林霉素、万古霉素、替考拉宁、庆大霉素、左氧氟沙星、利福平、复方新诺明、达托霉素、利奈唑胺和呋喃妥因，药敏板购自上海星佰生物科技有限公司。药敏结果判读根据美国国立临床标准实验室委员会(CLSI)2018 M100手册要求。

1.2.2DNA提取 将菌株接种于营养琼脂，37 ℃培养16～18 h，挑取足量的菌落重悬于无菌的生理盐水中，然后使用商品化的核酸提取试剂盒(QIAamp○RDNA Mini Kit)提取DNA。

1.2.3耐药基因检测 甲氧西林耐药基因(mecA)、四环素耐药基因(tetK、tetM)、红霉素耐药基因(ermA、ermB、ermC)、克林霉素耐药基因(linA)的引物序列参照文献[6-7]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，90 V，50 min在凝胶成像仪下判读结果。

1.2.4MLST分子分型 7个管家基因(arcC、aroE、glpF、gmK、pta、tpi、yqiL)的引物序列参照金黄色葡萄球菌MLST数据库(https://pubmlst.org/saureus/)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果上传到金黄色葡萄球菌MLST数据库进行在线分析，获取每个菌株7个管家基因的等位基因编号(allelic profile)，根据等位基因编号得出序列型(Sequence type，ST)。与数据库比对后数据库中没有的ST型，则为新发现的ST型。最后根据已获得的ST型使用eBURST分析软件进行聚类分析。

1.3数据处理 将数据录入SPSS24.0系统进行统计分析，分类资料采用卡方检验，非参数资料采用秩和检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。卡方分割采用Bonferroni校正P值。

2 结 果

2.1金葡菌的标本来源 2017年1月至12月，共收集227株金黄色葡萄球菌，其中分离自无菌部位样本67株(包括血液、脑脊液等)，占29.5%，分离自开放部位样本160株(包括分泌物、脓液、粪便、痰液等)，占70.5%。

2.2金葡菌耐药性 227株金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、头孢西丁、苯唑西林、克林霉素、左氧氟沙星、四环素、庆大霉素的耐药率较高，而对替考拉宁、利福平、复方新诺明、达托霉素、利奈唑胺以及呋喃妥因多呈敏感，耐药率均低于10%，且所有菌株均对万古霉素敏感。所有菌株的具体耐药情况见表1。

227株金葡菌中，耐三类以上抗生素的菌株，即多重耐药菌株98株，占43.1%。有1株对10种抗生素耐药，对全部15种抗生素均敏感的菌株有10株。

表1 金黄色葡萄球菌的耐药性

Tab.1 Drug resistance ofStaphylococcusaureus

抗菌药物耐药菌株数(n)耐药率/%苯唑西林11751.5头孢西丁12755.9青霉素20891.6四环素5323.3红霉素15668.7克林霉素9943.6万古霉素00替考拉宁73.0庆大霉素4519.8左氧氟沙星7533.0利福平31.3复方新诺明156.6达托霉素10.4利奈唑胺20.9呋喃妥因94.0

无菌部位分离的菌株平均耐药数为3.82种，开放部位分离的菌株平均耐药数为4.12种，两组菌株在耐药种数和不同抗生素耐药率均不存在统计学差异(均P>0.05)。苏北地区菌株平均耐药种数为4.49种，苏南地区平均耐药种数为3.74种，苏中地区平均耐药种数为3.75种，苏北地区耐药种数高于苏南地区菌株(Z=-2.206，P=0.027)。且苏北地区菌株克林霉素耐药率要高于苏中(χ2=5.643，P=0.018)和苏南地区(χ2=5.523，P=0.019)。

2.3MRSA与MSSA检出情况 本研究以更稳定的苯唑西林代替甲氧西林，将耐苯唑西林的金葡菌判定为耐甲氧西林金葡菌(MRSA)，共检出117株MRSA，检出率为51.5%。

无菌部位标本检出MRSA35株，开放部位标本检出82株，不同部位标本MRSA检出率无统计学差异(χ2=1.109，P=0.292)。苏北地区检出MRSA 45株，苏中地区菌株检出22株，苏南地区检出50株，3个地区之间MRSA检出率无统计学差异(χ2=0.288，P=0.866)。MRSA平均耐药种数4.81种(不计算苯唑西林)，甲氧西林敏感金葡菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus, MSSA)平均耐药种数2.14种，MRSA耐药种数高于MSSA(Z=-11.172，P<0.001)。且MRSA的庆大霉素耐药率高于MSSA(χ2=5.141，P=0.023)。

2.4耐药基因携带情况 227株金黄色葡萄球菌中，mecA、tetK、tetM、ermA、ermB、ermC、linA耐药基因的携带情况见表2，每株菌平均携带耐药基因1.51个。7种耐药基因都不携带的菌株有51株，共有16株菌最多携带4种耐药基因，最常见的4种耐药基因携带谱为mecA+tetK+ermB+ermC。

表2 耐药基因携带情况

Tab.2 Carriage of durg-resistance genes

耐药基因菌株数量(n)携带率/%mecA10747.1tetK3214.1tetM219.3ermA3214.1ermB3716.3ermC10144.5linA156.6None5124.2

无菌部位分离的菌株平均携带耐药基因数为1.58个，开放部位分离的菌株平均携带耐药基因数为1.48个。不同部位分离到的菌株耐药基因数不存在统计学差异(Z=-0.709，P=0.478)。MRSA菌株平均携带耐药基因数为2.15个，MSSA菌株平均携带耐药基因数为0.83个，MRSA携带的耐药基因数要高于MSSA(Z=-8.750，P<0.001)。苏北地区菌株平均携带耐药基因数为1.55个，苏南地区为1.35个，苏中地区为1.80个，苏中菌株耐药基因携带数要高于苏南地区(Z=-2.048，P=0.041)。

2.5金葡菌MLST分子分型 在227株金葡菌中发现了60个ST型，其中有29个为新发现ST型，包含59株菌，占比26.0%。新ST型数据信息已经上传数据库并获得新的ST型编号，分别为ST4842-ST4870。主要ST型分布情况见图1。

将所有ST型数据录入eBurst软件进行聚类分析，设定群所需最小相同等位基因数为6，取样自展值设置为1000，结果见图2。共有31个ST型分别以ST5，ST59，ST398，ST630和ST4495为节点聚类成5个簇，分别为CC5、CC59、CC398、CC630和C4495，成簇菌株138株，占比61.7%。

不同标本来源、不同地域的菌株主要ST型分布详见表3。

图1 主要ST型分布Fig.1 Distribution of major STs

图2 全部ST型聚类Fig.2 Cluster analysis of all STs

表3 不同标本来源、不同地域的菌株主要ST型分布

Tab.3 Distribution of major STs from different isolates and areas

ST型克隆群样本来源地区菌株耐药开放部位无菌部位苏北苏中苏南MRSAMSSAST59CC5925517310255ST398CC398191179141614ST630CC630114087114ST4863∗NA104617212

*表示新发现ST型，NA表示未归入克隆群

2.6成簇克隆群和金葡菌耐药特征的相关性 比较5个簇菌株的耐药种数，平均耐药基因数，抗生素耐药率和MRSA检出率，详见表4。CC5菌株耐药种数高于CC59(调整P=0.015)、CC398(调整P<0.001)、CC630(调整P=0.05)、CC4495(调整P=0.007)，CC59高于CC398(调整P=0.002)，CC630高于CC398(调整P=0.003)。

CC5耐药基因携带数高于CC59(调整P<0.001)、CC398(调整P<0.001)、CC630(调整P=0.037)、CC4495(调整P<0.001)，CC59高于CC398(调整P=0.02),CC630高于CC59(调整P<0.001),C630高于CC4495(调整P=0.042)。

CC4495菌株左氧氟沙星耐药率高于CC59(χ2=9.558，P=0.003)。CC5菌株的MRSA检出率高于CC398(χ2=14.131，P<0.001)、CC630(χ2=11.216，P=0.001)，CC59高于CC398(χ2=8.122，P=0.004)。

表4 不同簇菌株耐药相关特征比较

Tab.4 Comparison of drug-resistance characteristics in different clusters

平均耐药种数平均耐药基因数左氧氟沙星耐药率/%MRSA检出率/%CC56.38a3.24a42.9ab100aCC594.41bc1.90bde17.1a82.9aCC3982.69c1.11ce41.7ab52.8bCC6304.83b2.31d41.4ab69.0bCC44953.55bc1.18e63.6b81.8ab

注：耐药相关特征两两比较，同列数字后字母不同表示比较后有统计学差异(P<0.05)，字母相同表示比较后无统计学差异(P>0.05)。

3 讨 论

虽然有研究[8]发现院内MRSA的检出率近年来呈现下降的趋势，但是金葡菌的耐药形势仍然不容乐观，本研究发现临床分离的多重耐药金葡菌比例超过40%，MRSA的检出率也超过50%，检出率高于黎巴嫩报道的29.5%[9]和我国深圳地区的26.2%[10]。本研究中的金葡菌对多种抗生素的耐药结果与全国多数地区沈阳[11]、珠海[12]、广州[13]等地的临床分离株耐药率相近，但在江苏省内的苏北、苏中和苏南地区分离到的金葡菌菌株在耐药种数和克林霉素耐药率方面均存在差异，提示不同地区抗生素的使用和管理策略可能会对金葡菌耐药率产生影响。

本研究中金葡菌mecA和ermC携带率较高，均超过40%，与韩玉涛等[14]40.0%的结果相近，但高于贾珉等[15]的21.7%。而tetM、ermA、ermB携带率低于王冬梅等人[16]的研究结果，但高于安徽[17]报道的耐红霉素金葡菌的携带率。同时本研究结果提示苏北、苏中和苏南地区的金葡菌耐药基因携带数和携带率不尽相同，因此推测不同地区金葡菌对抗生素的主要耐药机制并不相同。本研究还检测了克林霉素耐药基因linA，阳性率仅为6.6%，远低于克林霉素的耐药率43.6%，推测克林霉素的耐药以诱导型耐药为主[18]。

金葡菌目前在MLST数据库中的ST型已经超过4 800个，而此次分离的227株金葡菌发现ST型60个，其中新发现ST型29个，呈现出较为丰富的种群结构特征。研究[19]发现ST5和ST239是我国院内分离的金葡菌最常见的ST型，在全国多个城市均有分离，同时也是院内MRSA的主要型别之一[20], 与之不同的是一项新西兰[21]的研究发现当地MRSA的主要ST型为ST8、ST93和ST1。而在本研究中所发现的ST5和ST239均为MRSA，但是MRSA中分布最多的ST型是ST59和ST398，MSSA中分布最多的是ST398和ST4863。而ST59和ST398则多为社区获得性MRSA(Community- Associated Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，CA-MRSA)的主要型别，而荷兰[22]和德国[23]的研究则认为在北美和欧洲ST398-MRSA是家畜相关MRSA(Livestock-Associated Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus，LA-MRSA)，在家畜和家畜养殖人员身上均有分离[24]，而在亚洲[25]与猪密切相关的ST型为ST9，但在本次研究中未发现ST9。 因此，本研究认为临床分离的金葡菌尤其是MRSA，社区获得的比例可能要高于院内获得的比例，因此导致感染人的比例也会偏高。同时本省不同地区分离的菌株在耐药率和耐药机制方面也存在着较为明显的差异，因此对于预防控制金葡菌感染，除了院内做好感控措施之外，对CA-MRSA应当予以更多的关注和监测。

利益冲突：无

引用本文格式：洪捷，曹阳，谈忠鸣，等.江苏地区金黄色葡萄球菌耐药及分子分型研究[J].中国人兽共患病学报，2019，35(7)：604-609. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.70