探讨电镜包埋时间对脂肪组织超微结构的影响

曲宝清 张琪 张翠萍 何萍 强桂芬

1.北京市神经外科研究所首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100070；

2.北京协和医学院中国医学科学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050

生物电镜制样技术十分繁复，不同的标本在处理时应根据其特性进行个性化处理，电镜样品的取材、制作非常关键。如果设计不合理，操作不规范，将造成实验试剂和时间上的浪费[1]。

脂肪生物学是当前研究肥胖及相关代谢性疾病的研究热点，脂肪细胞组成的脂肪组织是人体中一种特殊的结缔组织，包括白色脂肪与棕色脂肪，它们分别由白色脂肪细胞及棕色脂肪细胞组成[2]。白色脂肪细胞储存脂肪的球体内为大脂滴，是一种呈球状的单层膜细胞器，脂滴中90%～99%为甘油三酯，还有少量脂肪酸、甘油二酯、胆固醇及磷脂等，用于储存热量；棕色脂肪细胞内有数量多且大小不等的圆形脂滴，胞浆内含有较多的线粒体，间质有丰富的血管，脂滴和线粒体紧密联系，分解甘油三酯，发挥产热耗能的作用[3-4]。鉴于脂肪组织结构的特殊性，在电镜样品制备过程中，探索不同于常规的制备方法及包埋技术，将有助于提高电镜观察脂肪组织超微结构的准确性。本文分析和探讨透射电镜制样技术中的包埋时间对脂肪组织超微结构观察的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛购自MERCK公司；戊二醛购自SIGMA公司；磷酸盐缓冲液购自Coolaber公司；四氧化锇（OsO4）购自TED PELLA,INC公司；乙醇、环氧丙烷购自国药集团化学试剂有限公司；Epon812购自SPI公司。

1.2 实验动物

8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠，体重22～25 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（清洁级，许可证编号SCXK(京) 2016-0006）。

1.3 取材

4%水合氯醛（0.1 mL/10 g体重）腹腔注射麻醉小鼠，打开腹腔，下腔静脉取血后即刻进行取材，分别自附睾旁取出白色脂肪及背部肩胛区取出棕色脂肪，在冰上切成约1mm3大小，立即置于冰预冷的2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中，用于制作电镜标本和超微结构的观察[5-6]。

1.4 透射电镜样品前处理

将固定2小时后的白色脂肪和棕色脂肪，经0.1mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次，10min/次，后放置于磷酸盐缓冲液中，4℃冰箱保存。按照包埋时间分为三组：第一组为浸泡第2天进行组织包埋处理；第二组为浸泡第7天进行组织包埋处理；第三组为浸泡第14天进行组织包埋处理。

1.5 透射电镜样品制备

将浸泡于磷酸盐缓冲液中的白色脂肪和棕色脂肪，采用四氧化锇（OsO4）后固定2h，梯度乙醇脱水、环氧丙烷置换，Epon812环氧树脂浸透包埋，UC6（德国LEICA公司）型超薄切片机切取1μm的半薄切片，天青-亚甲基蓝染色，光镜观察并定位。用UC6型超薄切片机切取厚约80nm的超薄切片，醋酸双氧铀-硝酸铅染色后，HITACHI-H7650型透射电镜（日本日立公司）观察并拍照记录[7-8]。

2 结果

2.1 包埋时间对白色脂肪组织超微结构的影响

白色脂肪的光镜半薄切片结果显示，第一组白色脂肪细胞大而圆，细胞核和细胞器被挤压至细胞的一侧，胞膜光滑，胞浆内为染色单一的均质大型脂滴，呈单房结构（图1ⓐ）。第二组白色脂肪细胞形态略显不规则形，胞膜粗糙呈点状密集排列（图1ⓑ）。第三组白色细胞部分区域见脂肪细胞崩解，胞膜上见大小不一串珠样白色小泡（图1ⓒ）。

电镜观察超微结果显示，第一组白色脂肪组织脂肪细胞形态多为圆形，胞膜光滑，胞浆内为染色均质的脂类物质，并见少量线粒体，间质见血管结构（图1ⓓ）。第二组胞膜不光滑，沿胞膜有的圆形小泡分布，线粒体形态固缩(图1ⓔ)。第三组白色脂肪组织脂肪细胞形态不甚规则，胞膜界限不清且部分断裂，线粒体形态破坏，细胞内和胞浆内散在大小不等串珠样絮状无定形物质(图1ⓕ) 。

图1 三组白色脂肪组织光镜和电镜下细胞形态

2.2 包埋时间对棕色脂肪组织超微结构的影响

光镜观察半薄切片结果显示，第一组棕色脂肪组织内含大小不一的密集排列的脂肪细胞,间质内血管丰富，胞浆内脂滴为圆形且体积小，呈多房室结构（图2ⓐ）。第二组镜下见密集棕色脂肪细胞形态正常，脂滴为大小不等圆形，胞膜上偶见散在白色小泡（图2ⓑ）。第三组镜下脂肪细胞内大量大小不等，排列密集的不规则串珠样小泡（图2ⓒ）。

图2 三组棕色脂肪组织光镜和电镜下细胞形态

电镜下超薄切片观察结果显示，第一组棕色脂肪细胞密集，胞膜光滑，界限清晰，胞浆内见大量线粒体及大小不等脂滴，脂滴形态为圆形且光滑，间质见血管结构（图2ⓓ）。第二组见脂肪细胞胞膜不光滑，胞膜褶皱，胞浆内线粒体肿胀，脂滴多为圆形，脂滴旁见亮色圆形小泡(图2ⓔ）。第三组镜下见脂肪细胞胞膜界限不清，线粒体形态异常，胞浆内见大片无规则形亮色物质，散在胞浆内且大多分布脂滴周边，形成串珠样改变(图2ⓕ)。

3 结论

脂肪分为白色脂肪和棕色脂肪，白色脂肪主要储备脂质，是维持体温和产热的主要器官；而棕色脂肪则是专属的非寒颤产热器官，在能量代谢中发挥重要作用[9-10]。棕色脂肪其组成的脂肪细胞含有众多的线粒体和丰富的血管，其数量远远超过白色脂肪[11]。

在脂肪组织电镜样品制备过程中，多聚甲醛-戊二醛固定液使脂肪细胞内的蛋白成分固定，锇酸又固定了细胞内的脂类物质，棕色脂肪内存在的大量线粒体和血管成分夹裹着多个脂滴[12]。白色脂肪细胞内仅有一个贮存脂肪的球体，单一球体将细胞核等挤到细胞的周边，使细胞浆成为一个薄薄的环，包围着脂肪球体[13-14]。通过电镜下观察对比发现，白色脂肪细胞内除脂滴这种特殊的细胞器之外，其他细胞器稀少；棕色脂肪细胞内脂滴多，大小不一呈多房结构。脂肪细胞整体上稳定性差，对外界诸如渗透压等环境因素比致密的组织细胞更容易受到破坏[15]。正是脂肪细胞特殊的结构特征，长时间放置在缓冲液内使脂类物质的微细结构发生较大变化，电镜下无法观察其原生形态结构，造成实验材料、标本、人力、物力和时间成本的浪费，影响实验结果。

生物电镜标本制备技术复杂繁琐，环节很多，不同的标本应根据其生物特点选择合适的实验方法和流程, 才能做到万无一失，得到高质量的电镜结果，从而达到预期的实验目的。脂肪组织的电镜样品制备过程中，应在尽量短的时间内进行包埋，制备新鲜的电镜样品，尽可能地稳定细胞膜结构，减少细胞膜破裂，细胞内脂类析出，才能真实反映脂肪组织表面以及脂肪细胞间的结构关系。