北方社区中老年人群血浆中同型半胱氨酸水平与视网膜血管直径的相关性研究

刘欣欣 卢爱东 王亚星 魏文斌 陈朔华 吴寿岭

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是含有细胞毒性的一种含硫氨基酸，是蛋氨酸脱甲基过程中产生的中间代谢产物。近期有研究提出，升高的Hcy水平是冠心病(coronary heart disease，CHD)等心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)死亡的独立危险因子[1]。高Hcy水平除了被广泛用作CVD的预测因子外，有研究发现，Hcy和非心脏血管疾病之间的关系同样密切，高Hcy血症与颅内动脉粥样硬化性狭窄有关，与中风、外周动脉疾病、颈动脉疾病、慢性肾脏疾病、动脉粥样硬化性肾动脉狭窄、腹主动脉瘤和勃起功能障碍均相关[2]。既往对Hcy在眼内血管性病变中的作用和影响方面研究发现，高Hcy在年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞的发病过程中均扮演了重要的角色[3-5]，但这些研究多局限在已发病患者的眼内局部组织的生理改变，血浆中Hcy水平和大型人群中的眼内血管变化情况的关系却少有研究报道。

在流行病学调查中，多利用眼底彩色照相技术对视网膜血管进行定性观察和定量测量，从而对其与心脑血管疾病的关系进行研究。研究表明，视网膜微血管的改变可以用作观测和指示指标对全身微血管病变的临床前期进行评估[6]。然而，对于血浆内Hcy水平和视网膜微血管改变的研究尚少。本研究将从流行病学方向，采用计算机分析软件及国际标准公式对视网膜血管直径进行定量测量，从而对血浆内Hcy水平与视网膜微血管改变间的关系进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料开滦研究(注册号：ChiCTR-TNC-11001489)中2012-2013年参加健康体检(年龄≥40岁)并自愿行眼部检查并行眼底彩色照相的人群。开滦研究是基于河北省唐山市开滦社区对开滦集团在职及离退休员工进行健康体检并随访的前瞻性队列研究。人群来源：2006年6月至2007年10月和2008年6月至2009年10月由开滦总医院等11家医院对开滦集团在职及离退休职工分别进行2次健康体检。2009年12月由首都医科大学附属天坛医院脑卒中临床试验和研究中心人员，在上述健康体检职工中按2005年全国1%人口抽样调查所得的40岁以上全国人口性别和年龄的比例[7]，根据每2岁一个年龄段按比例分层随机抽取开滦集团职工作为观察人群，并于每2 a一次对观察人群进行体检。本课题采用的是2012-2013年的横断面人群资料。

1.2 纳入标准和排除标准纳入标准：(1)年龄≥40岁；(2)种族、年龄不限；(3)无认知能力障碍，可完成调查问卷者；(4)同意参加此研究并且签署知情同意书者。排除标准：(1)既往史有缺血性脑卒中、脑出血、蛛网膜下腔出血病史者；(2)既往有心肌梗死病史者；(3)未能完成眼底彩照检查者或采集眼底照片质量不符合软件分析要求者。

1.3 流行病学调查、人体测量指标和生化指标检测开滦队列研究均采用一致性的流行病学调查问卷及人体测量指标和生化指标检测，可见本课题组已发表文献[8-9]，其中本研究的调查员及体检医师均为固定人员且经过统一培训。血压测量方法：受试对象于体检当天上午测量前30 min内禁止吸烟或饮茶、咖啡，背靠静坐15 min后进行血压测量。应用经校正的汞柱式血压计来测量受试者右侧肱动脉血压，连续测量3次，结果取均值。吸烟的定义为受试者每天至少吸一支烟，至少持续1 a以上；饮酒的定义为受试者每天平均饮白酒(酒精含量50%以上)100 mL，至少持续1 a以上。测量身高(精确到 1 mm)和体质量(精确到0.1 kg)，计算其BMI(kg·m-2)。于体检当天上午700-900抽取受试者空腹肘静脉血5 mL，分离并提取血清，用于生化测量指标的检测。生化指标包括：空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、高敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hsCRP)及Hcy等。所有受试者血清统一用日立7600自动生化分析仪检测，并由同一组专业检验医师进行操作。Hcy采用免疫比浊法测定，试剂盒由北京九强生物技术有限公司提供，操作过程严格按照试剂说明书进行，随批质控。

1.4 视网膜血管直径的测量由熟练的眼科技师操作免散瞳眼底彩色照相仪(Type CR6-45NM；Canon，Ota，Tokyo，Japan)拍摄受试者的彩色眼底照(45°)，分别以其双眼视盘和黄斑为中心进行照片采集。均选用受试者右眼彩色眼底照片，利用计算机分析软件(IVAN；University of Wisconsin，Madison，WI)测量眼底距离视盘边缘0.5～1.0 PD的6条较大的视网膜分支动脉和静脉直径，使用 Knudtson-Parr-Hubbard 公式[10]计算下列参数：视网膜中央动脉直径(central retinal artery equivalent，CRAE)、视网膜中央静脉直径(central retinal vein equivalent，CRVE) 和视网膜动静脉比(arteriovenous ratio，AVR)。

2 结果

2.1 一般情况2012-2013年行全身及眼部检查的查体人群(年龄≥40岁)共3447人，其中男1936人。排除输入错误导致血管极值26人，未进行Hcy检查的人数20人，纳入本研究统计分析人群3401人，男1910人、女1491人。研究对象年龄为(56.81±10.17)岁，Hcy为0.09～70.60(15.27±9.11)mmol·L-1，其中CRAE为(174.29±24.59)μm、CRVE为(281.74±28.66)μm、AVR为0.62±0.11。将Hcy按四分位分组(Hcy四分位数分别为9.50 mmol·L-1、13.30 mmol·L-1、18.20 mmol·L-1)，体检人群的相关因素测量值见表1。

表1 所有观察对象的基线情况

注：SBP：收缩压；1 kPa=7.5 mmHg

2.2 Hcy与CRAE、CRVE、AVR间相关性分析Spearman相关分析显示，Hcy与CRAE呈负相关(r=-0.125，P<0.001)，与CRVE呈负相关(r=-0.093，P<0.001)，Hcy与AVR也呈负相关(r=-0.050，P=0.004)

2.3 影响CRAE、CRVE、AVR的多因素线性回归分析模型1分别以CRAE、CRVE和AVR作为因变量，Hcy测量值作为自变量，采用线性回归分析Hcy对CRAE、CRVE和AVR的影响，结果显示，Hcy是CRAE(β=-0.292，P<0.001)、CRVE(β=-0.241，P<0.001)和AVR(β=-0.001，P=0.003)的影响因素。模型2在模型1的基础上校正了年龄、性别，结果显示，Hcy是CRAE(β=-0.101，P=0.034)和CRVE(β=-0.142，P=0.004)的影响因素，对AVR的影响不具有相关性。在考虑了全身各因素的共线性后，模型3在模型2的基础上进一步校正了BMI、SBP、FBG、LDL-C、HDL-C、hsCRP、吸烟、饮酒后，结果显示，Hcy仍是CRAE(β=-0.120，P=0.020)和CRVE(β=-0.147，P=0.006)的危险因素，即Hcy每增加一个单位，CRAE下降幅度为0.120 μm，CRVE下降幅度为0.147 μm；同时可见，年龄和SBP是CRAE的危险因素，性别是CRAE的保护因素；年龄、HDL-C、LDL-C和hsCRP均是CRVE的危险因素；BMI、收缩压是AVR的危险因素，性别则是保护因素。见表2、表3和表4。

表2 影响CRAE的多因素线性回归分析

注：a调整R2=0.012；b调整R2=0.070；c调整R2=0.087

表3 影响CRVE的多因素线性回归分析

注：a调整R2=0.007；b调整R2=0.053；c调整R2=0.061

表4 影响AVR的多因素线性回归分析

注：a调整R2=0.002；b调整R2=0.014；c调整R2=0.042

2.4 影响AVR的多因素Logistic回归分析正常AVR约为2/3，故将AVR<0.67及≥0.67分为两组，模型以AVR分组为因变量，以Hcy四分位分组为自变量，同时校正多种因素，以第一分位组为对照，采用Logistic回归分析Hcy对AVR分组的影响，结果显示，同第一分位组相比，第二分位组、第三分位组、第四分位组均不是AVR的危险因素(均为P>0.05)，OR值分别为0.985(95%CI为0.757～1.283)、1.094(95%CI为0.851～1.407)和1.046(95%CI为0.815～1.343)。见表5。

表5 影响AVR的多因素Logistic回归分析

2.5 性别分层计算影响CRAE、CRVE、AVR的多因素线性回归分析因为性别与Hcy存在交互作用，故而将性别进一步分层，分别以CRAE、CRVE和AVR作为因变量，Hcy测量值作为自变量，同时校正多种因素后，采用线性回归分析在性别分层情况下Hcy对CRAE、CRVE和AVR的影响，结果发现，在男性中，Hcy是CRAE(β=-0.132，P=0.035)和CRVE (β=-0.136，P=0.048)的危险因素，在女性中，Hcy对CRAE和CRVE的影响无统计学意义；Hcy与AVR在男女人群中均未见有统计学意义的明显影响。

3 讨论

Hcy是各种CVD的危险因素，可以影响血管内皮产生的NO生物利用度，从而加重氧化应激反应，导致内皮功能障碍的危险性增加，内皮细胞凋亡,进而形成慢性炎症、血栓形成，造成血管管腔狭小及粥样硬化[11]。视网膜微血管与脑部微血管在形态和生理上具有很多相同特性，被证实与体内心脏、肺脏和脑部的微血管具有同源结构[12]。有研究发现,视网膜血管微循环结构的改变与心脑微循环疾病，如高血压[13]、动脉粥样硬化、中风、阿尔兹海默等疾病有密切相关性，是心脑血管事件重要的观测因子。同时，视网膜血管直径在其他全身性血管性疾病中，如精索静脉曲张和肾脏疾病中也被发现有明显的改变和评估作用[14]。

本研究发现，Hcy与CRAE(r=-0.125，P<0.001)、CRVE(r=-0.093，P<0.001)和AVR(r=-0.050，P=0.004)均有相关性。将Hcy分别和CRAE、CRVE和AVR进行多因素线性回归分析，结果显示，Hcy是CRAE(β=-0.292)和CRVE(β=-0.241)的危险因素(均为P<0.05)，在逐步校正了心脑血管多种混杂因素后，这种影响关系仍然存在(CRAE：β=-0.120，CRVE：β=-0.147，均为P<0.05)。而在矫正了心脑危险因素后，Hcy对AVR的影响则无统计学意义，我们分析可能原因为AVR为CRAE与CRVE的比值，在CRAE和CRVE的值同时随着Hcy的增加而减小的时候，幅度相近，比值变化不明显，进一步将AVR转化为分类变量进行回归分析，发现Hcy并不是AVR的危险因素，即随着血浆中Hcy的含量增加，视网膜血管的动静脉直径均呈减小的趋势，且趋势相近，AVR未见影响。这与既往研究不尽相同，Gopinath等[15]在Blue Mountains Eye Study对2334名(≥49岁)人群进行研究发现，整体人群中Hcy和血管直径未见关联，而Hecke等[16]在Hoorn Study对256名(年龄60～85岁)人群进行研究，在矫正了年龄、性别和糖耐量后发现，随着Hcy增高CRAE出现和CRVE均减小，但是只有CRAE的关联有统计学意义。

Omae等[17]研究发现，氧化应激和明显的蛋白激酶信号通路均参与Hcy介导的效应，Hcy通过介导与P38激酶相关的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NAD(P)H oxidase)产生过氧化物，从而影响依赖NO介导的血管内皮反应，导致视网膜小动脉扩张，或许可以从生理学角度解释本研究中随着Hcy的增高、CRAE减小的现象。同时如前所述，在既往的心脑血管研究中发现，Hcy影响依赖于NO的血管内皮，可以造成血管的管腔狭窄，眼底血管与心脑血管具有同源结构。本研究发现，随着Hcy的增高，CRVE减小，推测视网膜小静脉发生了和心脑等全身血管相同的生理反应。

我们的研究在带入心脑血管因素行多因素分析发现，CRAE与年龄、性别和血压的关系亦有统计学意义，CRVE与年龄、HDL-C、LDL-C和CRP的关系亦有统计学意义，这与既往研究大致相同[16]。我们将性别进一步分层发现，随着Hcy的增高，CRAE和CRVE减小的现象只存在于男性而不是女性人群，Gopinath等[15]将性别分层进行多因素线性回归分析，同时在调整了年龄、血压、吸烟、糖尿病、叶酸和维生素B12水平时发现，只在男性人群中发现Hcy与CRAE有相关性，是其危险因素；但是同样的结果在CRVE中却未发现，这与我们的结果有相似之处，但是性别因素在Hcy和眼底血管直径中的关系中所起的影响还需要进一步研究。

总之，本研究发现了我国北方人群中视网膜小动脉和小静脉的狭窄均与血浆中Hcy水平的升高有关联，而这种关联似乎只存在于男性人群中，需要进一步进行前瞻性研究来验证性别差异，并确认Hcy与视网膜小血管直径之间实时的关系。本发现为Hcy可能会影响全身微循环提供了更进一步的证据，同时眼底血管直径的变化可以和Hcy一起作为心脑血管事件的监控和预测因子。